一方で、イベリアトゲイモリがマウスほど広く利用されるまでに時間を要した背景もある。その大きな要因の一つが、巨大なゲノムサイズである。Pleurodeles waltl のゲノムは約20 Gbに達し、ヒトの約7倍、マウスの約7.4倍にも相当する。この巨大ゲノムは、主として反復配列、とくにトランスポゾンの蓄積によるものであり、比較ゲノム解析や遺伝学的基盤の整備を容易でないものにしてきた。ただし近年、その状況は大きく変わりつつある。2017年にはトランスクリプトーム[10]が、2025年には20.3 Gbの染色体スケールゲノムが公表[11]されるなど、本種を分子・遺伝学的に扱うための基盤は急速に整いつつある。また、イベリアトゲイモリは現在NBRPツメガエル・イモリから入手可能であり、少なくとも国内では共通資源として利用できる体制が整いつつある。私たちが扱っている系統でも、兄妹交配は14世代以上まで進んでいる。こうした流れを見ると、イベリアトゲイモリは、従来の「研究材料としてのイモリ」から、少しずつ「実験動物としてのイモリ」へ近づいてきていると感じる。

【表1：イベリアトゲイモリ、アカハライモリ、マウスの特徴比較表】

私がいま特に重要だと感じているのは、イベリアトゲイモリを本当の意味で実験動物として活用していくための基盤整備である。第一に挙げられるのは、遺伝的コントロールと安定した供給体制である。遺伝的背景のそろった個体群を継続的に利用できることは、研究の再現性を支える基本条件である。これはマウスでは当然の前提となっているが、有尾両生類では長く実現が難しかった。

その背景には、有尾両生類に特有の繁殖上の制約がある。表に示すように、例えばアカハライモリでは性成熟までに時間を要し、繁殖も季節に依存するため、計画的に世代を進めることが難しい。また、一度に得られる卵数も限られるため、多数の同腹個体を安定して確保することも容易ではない。こうした点が、近交系の樹立や、遺伝的背景をそろえた実験群の作出を妨げてきた。

これに対して、イベリアトゲイモリは実験室内での繁殖性が高く、体外受精によって多数の胚を計画的に得ることができる。そのため、同じ親に由来する胚や幼生を用いた実験設計が可能となり、発生段階や飼育条件をそろえた解析を行いやすい。この点は、本種を実験動物として発展させるうえで大きな利点である[1,2,10,11]。

ただし、実験動物化というと、遺伝子や系統の話だけに目が向きがちだが、実際にはそれだけでは足りない。日常の飼育管理そのものを整えることが必要である。飼育密度、共食い防止、水質管理、変態期の管理、採卵メスへの負担軽減、餌の標準化、逃亡防止といったことは、一見地味ではあるが、どれも再現性と福祉の両方に関わる。イベリアトゲイモリ標準飼育プロトコルでも、共食い防止のための低密度飼育、給餌後の速やかな換水、変態期の清潔な水環境、生き餌や生肉を標準系では避けることなどを、実験動物学的配慮として重視している[9]。両生類の“Refinement”を考えるというのは、麻酔や安楽死だけでなく、こうした日常管理を含めて見直すことだと思う。

そのなかでも、麻酔法と安楽死法の整備は避けて通れない。両生類では、同じ種であっても発生・成長段階によって反応が大きく異なり、哺乳類のように一律には考えにくい[12]。緩衝化されたトリカインメタンスルホネート（MS-222）への浸漬は、両生類の麻酔に広く用いられる方法である。MS-222は水溶液中で酸性を示すことが知られており、AVMA 安楽死ガイドライン2020[13]や海外の複数のIACUC手順書[14,15]において、生きた水棲動物にMS-222を使用する場合には、pH 7.0〜7.5に緩衝することが求められている。私も、MS-222を通常の飼育水（水道水）に溶かしただけでは強酸性（pH3付近）を示すことを確認しているため、炭酸水素ナトリウムで中和して利用している。成体のイベリアトゲイモリでは、中和したMS-222 0.1％に約10分浸漬することで深い麻酔状態に到達する。一方、この条件は変態前の幼生には濃すぎ、不適切である。つまり、同じ種であっても成長段階に応じた条件設定が必要になる。こうした点は、両生類を実験動物として扱ううえで、今後さらに整理していくべき部分である。なお、MS-222は、米国、カナダ、英国等において、魚類を中心とする水棲動物用の麻酔・鎮静薬として承認・流通しているが、日本では未承認なので純度の高い試薬を適切に調製して用いる。

さらに難しいのは死亡確認である。両生類では、呼吸が止まっていても、それだけで死を確認したことにはならない。見かけ上の不動化と、不可逆的な死亡とは分けて考える必要がある。AVMA 安楽死ガイドライン2020では、両生類について二段階あるいは三段階法が重視され、麻酔薬浸漬の後に物理的処置を加えることが例示されている。また、例外として認められる場合があるが、単独での凍結は受け入れられない方法とされている[13]。私自身は、MS-222浸漬による意識消失を確認した後、12時間以上の凍結を加えることで確実に安楽死に至ることを確認している。今後はAVMA安楽死ガイドラインを参考にイベリアトゲイモリにより適した方法について整理していきたいと考えている。このように、細かな検討はまだ必要であるが、少なくとも両生類では、麻酔も安楽死も「一般論」だけでは済ませられない。

今後さらに重要になるのは、病原微生物管理と個体識別である。遺伝的背景がそろっていても、微生物学的背景が不明であれば、研究の再現性は揺らぐ。しかも両生類では、単に施設内の飼育管理の問題にとどまらず、ツボカビやラナウイルスのように、野外個体群や環境にも影響しうる感染症を意識する必要がある[14]。したがって、病原微生物モニタリング、クリーニング法、隔離導入、排水管理などを、今後しっかり整えていく必要がある。また、長期飼育、繁殖管理、実験追跡のすべてに関わる個体識別法の確立も欠かせない。こうした項目は派手ではないが、実験動物として使っていくためには避けて通れない基盤である。

鳥取大学・研究推進機構 大林徹也

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