精子をフリーズドライする方法

では、ここからはフリーズドライ精子の作製から産子作出までの方法について具体的に解説していきます。まず、フリーズドライ精子の作製はどのように行うのか。その方法は意外と簡単です。生体から採取した精子は、トリス-EDTAバッファーと呼ばれる溶液に混ぜます。その後ガラスアンプルに充填し、凍結乾燥機で乾燥させるだけで完成します（図1）¹⁰。トリス-EDTAバッファーは、分子生物学研究で一般的に用いられている溶液で細胞から抽出したDNAを長期に保存することができる溶液です。精子がフリーズドライ保存できることが分かった当初は、細胞の培養に使用する溶液を用いてフリーズドライされていました。しかし、この方法では保存期間が長くなるにつれて、精子がダメージを受けてしまうことが分かりました。そこで、どうしたら精子がダメージを受けずに受精能力を持ち続けるか検討が始まります。精子が卵子と受精するには、まず精子が卵子表面に到達するための運動性が必要になります。しかし、運動性は受精後の胚の発生には関係なく、最終的に産子が誕生するためには、精子の中のDNAが正常でなければならないということに行き着きました。その結果、精子のDNAをフリーズドライした後も正常に維持する溶液を長年検討する中でトリス-EDTAバッファーの利用を思いつきました。そして、実際にこの溶液を用いて精子をフリーズドライしたところ、高い受精能力を維持できることが明らかとなりました¹⁰。さらに、精子DNAを分解する酵素は、温度上昇により活性を高めることが分かったため、フリーズドライ精子を4℃で保存したところ、分解酵素の活性を抑制することができ長期間保存することに成功しました。細胞を保存するためには、細胞を破壊するあらゆる要素から守るために多くの試薬や細胞保護物質を混ぜた溶液を作らないといけないと思っていましたが、たった2種類の試薬を含むトリス-EDTAバッファーで精子のDNAが保存できてしまったことは驚きでした。このように、精子DNAを保護してフリーズドライすることに成功しましたが、現在のフリーズドライ法では運動性を維持することができないため、水で戻した精子は、その形はきれいに維持しているものの運動性は復活できないというのが現状です。

動かないフリーズドライ精子から産子は得られるのか？

精子を卵子と受精させるには、人工受精や体外受精が用いられます。この方法は精子に運動性がないと成立しない技術であるため、水に戻した後動かないフリーズドライ精子にこの受精方法は使えません。では、どのようにフリーズドライ精子を卵子と受精させるのか。その方法は顕微授精です。顕微授精は、微細なガラス管に精子を吸引し、そのガラス管を卵子内に挿入することで受精させる技術であり、別名ICSI（Intracytoplasmic Sperm Injection；イクシー）と呼ばれる動物だけでなくヒトの不妊症治療の主力技術として利用されている技術です（図2）。ICSIは、受精の概念を大きく変えた技術であり、これまで動かない精子や運動性が極端に低い精子は受精できない精子として認識されていたのが、ICSIにより産子が誕生したことで動かない精子でも受精能力を維持していることが証明されました。さらに、ICSIを用いることで形成過程の未熟な精子からも産子を誕生させることができるようになり、体外での受精技術は革新的に進化しました。現在、多くの動物種でフリーズドライ精子から産子が得られているのも、ICSIの技術開発が大きく影響しています。

我々はこれまで、冷蔵庫で3～5年間保存したマウス・ラットのフリーズドライ精子から産子を誕生させることに成功しており、フリーズドライ精子保存法は遺伝資源を保存する技術として十分活用することができます^11-12。また、マウス・ラット以外にも上述した多くの動物で成功例が報告されていることから、今後ますます利用が多くなることが予想されます。

卵子や受精卵はフリーズドライ保存できるの？

ここまで、精子のフリーズドライ保存法の実際についてご紹介してきましたが、卵子や受精卵はフリーズドライ保存できるのか疑問に思う方もいらっしゃると思います。現時点では、卵子や受精卵のフリーズドライ保存に成功したという報告はありません。卵子や受精卵は他の細胞と比べて非常に大きな細胞であるため、フリーズドライ保存が難しく成功に至っていませんが、今後の科学の進歩が期待されます。さらに、フリーズドライ精子も現在運動性を維持できていませんが、将来運動性を持つフリーズドライ精子が作製できるようになれば、顕微授精が難しい施設や動物種でも人工授精や体外受精を使って産子を誕生させられるようになるかもしれません。

最後に

フリーズドライ精子保存法は現在、動物において実用化レベルにまで開発することができていますが、まだ改良しなければならない課題もあります。しかし、これまで多くの動物種で成功例が報告されており、筆者らも精子フリーズドライ保存法の活躍の場を広げるために、この方法を絶滅危惧種の保全に応用しています¹³。これまでに約70種の野生動物の精子を保存しており、この中にはヤンバルクイナ、オオワシ、オジロワシ、ツシマヤマネコ、アマミノクロウサギといった国内の絶滅危惧種も含まれています。我々が開発した技術が動物を絶滅から守ることにつながってほしいと思います。

今回のコラムで、生物、細胞が持つポテンシャルを知り、少しでも興味を持っていただければ幸いです。詳しい研究内容は当研究室のHPをご覧ください¹。

参考文献

1.　大阪公立大学大学院獣医学研究科実験動物学教室　https://www.omu.ac.jp/vet/las

2.　Kaneko T, Sakuma T, Yamamoto T, Mashimo T. Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos. Sci Rep. 4: 6382, 2014. doi: 10.1038/srep06382.

3.　 Kaneko T, Mashimo T. Simple Genome Editing of Rodent Intact Embryos by Electroporation. PLoS One. 10: e0142755, 2015. doi: 10.1371/journal.pone.0142755.

4.　Kaneko T.Genome Editing in Mouse and Rat by Electroporation. Methods Mol Biol. 2637: 125-134, 2023. doi: 10.1007/978-1-0716-3016-7_10.

5.　Kaneko T, Endo M, Tsunoda S, Nakagawa Y, Abe H. Simple induction of pseudopregnancy by artificial stimulation using a sonic vibration in rats. Sci Rep. 10: 2729, 2020. doi: 10.1038/s41598-020-59611-1.

6.　Endo M, Tsunoda S, Tawara H, Abe H, Kaneko T. Successful pseudopregnancy of rats by short period artificial stimulation using sonic vibration. Sci Rep. 12: 1187, 2022. doi: 10.1038/s41598-022-05293-w.

7.　Wake Y, Endo M, Tsunoda S, Tawara H, Abe H, Nakagawa Y, Kaneko T.Successful induction of pseudopregnancy using sonic vibration in mice. Sci Rep. 13: 3604, 2023. doi: 10.1038/s41598-023-30774-x.

8.　Kaneko T. Simple gamete preservation and artificial reproduction of mammals using micro-insemination techniques. Reprod Med Biol. 14, 99-105, 2015. doi: 10.1007/s12522-014-0202-4.

9.　Kaneko T. Sperm freeze-drying and micro-insemination for biobanking and maintenance of genetic diversity in mammals. Reprod Fertil Dev. 28, 1079-1087, 2016. doi: 10.1071/RD15386.

10.　Kaneko T. Simple sperm preservation by freeze-drying for conserving animal strains. Methods Mol Biol. 1239, 317-329, 2015. doi: 10.1007/978-1-4939-1862-1_19.

11.　Kaneko T, Serikawa T. Long-term preservation of freeze-dried mouse spermatozoa. Cryobiology 64, 211-214, 2012. doi: 10.1016/j.cryobiol.2012.01.010.

12.　Kaneko T, Serikawa T. Successful long-term preservation of rat sperm by freeze-drying. PLoS One 7, e35043, 2012. doi: 10.1371/journal.pone.0035043.

13.　Kaneko T, Ito H, Sakamoto H, Onuma M, Inoue-Murayama M. Sperm preservation by freeze-drying for the conservation of wild animals. PLOS ONE. 9, e113381, 2014. doi: 10.1371/journal.pone.0113381.

Topical Minoxidil Exposures and Toxicoses in Dogs and Cats: 211 Cases (2001-2019)

Kathy C. Tater, MPH, DVM, DACVD, Sharon Gwaltney-Brant, DVM, PhD, DABVT, DABT, Tina Wismer, MS, DVM, DABVT, DABT 

 Am Anim Hosp Assoc. 2021 Sep 1;57(5):225-231.  doi: 10.5326/JAAHA-MS-7154.

ミノキシジルは、CM等で宣伝されている育毛剤の主要成分です。この研究は、データベースに登録されている過去の症例報告に基づき、疾患の要因と発症の関連を調べた後ろ向き研究（retrospective study）であるため、エビデンスレベルは高くありません。本当の意味で犬・猫におけるミノキシジルの毒性を調べるためには、実験的に犬猫にミノキシジルを摂取させる（動物実験）、あるいは育毛剤を使用している飼い主と、使用していない飼い主に飼育されている犬猫の中毒症状の発症率を調べる、前向き研究（prospective study）が必要です。しかしながら、ミノキシジルの毒性については、種差（人間には安全な濃度でも、犬猫には危険）があり、犬猫は少量摂取するだけで臨床症状を呈する可能性があるので、育毛剤の保管や廃棄には十分注意が必要でしょう。また、ミノキシジルは重度の中毒を起こす危険性があるため、犬や猫の脱毛症の治療には使用しない方が良さそうです。

（要旨）

　この論文では、犬と猫におけるミノキシジルへの曝露と中毒の疫学を明らかにするために、米国の動物虐待防止協会の動物毒物管理センターにおけるデータベースに登録されているミノキシジル外用薬に暴露した犬と猫211症例を調べました。臨床的に中毒症状を呈した87例（猫62例、犬25例）については、病歴を詳細に検討しています。猫の場合、最も一般的な暴露状況としては、飼い主が自分の脱毛のためにミノキシジルを塗布している間の、意図しない摂取（例：ペットが飼い主の皮膚や枕カバーを舐めた、薬をこぼしたときにペットが飛び散った）が、最も一般的な暴露状況でした。犬では、探索行動（例：ゴミ箱の中を探す）による暴露状況が最も多く認められました。臨床症状を呈した症例では、ほとんどが中等度または重度の疾患を発症し犬56.0％、猫59.7％）、猫の場合、飼い主がミノキシジルを使用した後に臨床症状を呈した62例中８例（12.9%）が死亡しています。因果関係については、検討の余地はありますが、ペットの飼い主は、ミノキシジルの偶発的な暴露による犬や猫の中毒のリスクについて知っておく必要があります。

3.　イヌの腫瘍疾患に対する創薬研究

　イヌの死因の約3割は悪性腫瘍（がん）であるとされており、特に高齢犬ではその傾向が高いです。イヌの腫瘍に対しては現在、外科療法・放射線療法・化学療法の3大療法が主として用いられていますが、高齢犬の体への負担や副作用、がん種と療法との相性などの面で制限を受ける場合も多く、3大療法に加えて新たな治療戦略の開発が望まれています。我々はまず、イヌにおいても、悪性黒色腫や血管肉腫、肥満細胞腫等を中心とした数々の悪性腫瘍においてPD-L1 が高発現していること、またこれに対する抗PD-L1 モノクローナル抗体を用いてその免疫抑制機序を遮断するとイヌ免疫担当細胞の機能を回復できることを明らかにしました（Maekawa et al., PLoS One. 2014. 9(6):e98415. Maekawa et al., PLoS One. 2016. 11(6):e0157176）。そこで、イヌの腫瘍治療に応用できる免疫チェックポイント阻害薬としてイヌ用の抗PD-L1抗体医薬品を開発し、難治性の悪性腫瘍に罹ったイヌに対する臨床応用研究を北海道大学動物医療センター高木 哲准教授（現麻布大学・教授）と行いました。その結果、悪性黒色腫と未分化肉腫に罹ったイヌの一部で、明らかな腫瘍の退縮効果が確認され、さらに悪性黒色腫では肺に転移した後の生存期間を延長する効果も得られました。

　●　2017年8月25日：イヌのがん治療に有効な免疫チェックポイント阻害薬（抗PD-L1 抗体）の開発にはじめて成功～北海道大学動物医療センターにおける臨床研究成果～

(https://lab-inf.vetmed.hokudai.ac.jp/content/files/Research/2017.8.25_jyu.pdf)

　●　 New therapeutic antibody for dog cancers

(https://www.global.hokudai.ac.jp/blog/new-therapeutic-antibody-for-dog-cancers/)

　さらに、肺に転移した悪性黒色腫をもつイヌ 29 頭（ステージ4 （末期がん））に対し、抗 PD-L1 抗体による試験的治療を行ったところ、イヌで肺転移巣を含む腫瘍の退縮が観察されたほか、北海道大学動物医療センターにおいて治療した過去の症例と比べ、抗 PD-L1 抗体治療群では有意に生存期間が長いことが明らかになりました。

　●　2021年2月15日：続報・肺転移のあるイヌ悪性黒色腫に抗PD-L1抗体が有効であることをはじめて実証 ～イヌ用免疫チェックポイント阻害薬の実現に大きく前進～

(https://www.hokudai.ac.jp/news/pdf/210215_pr.pdf)

　●　New therapy target for malignant melanomas in dogs

(https://www.global.hokudai.ac.jp/blog/new-therapy-target-for-malignant-melanomas-in-dogs/)

　しかし、奏効（がんの退縮効果）が得られるイヌは一部にとどまっていました。そこで、それまでに抗 PD-L1 抗体による治療を行った肺転移のある口腔内悪性黒色腫のイヌについて回顧的な解析を行うことで、放射線療法と抗 PD-L1 抗体療法の組み合わせがより良い治療効果に繋がるかを検討しました。その結果、放射線治療歴の有無やそのタイミングが抗 PD-L1 抗体の治療効果と相関することを発見しました。すなわち、「RT（放射線療法）なし群」では、20頭中2頭で肺転移病変が抗 PD-L1 抗体治療に反応し（完全奏効1頭及び維持1頭）、 臨床的有用率は 10.0%でしたが、「RT 前治療群」では、9頭中4頭で完全奏効及び1 頭で維持／部分奏効が認められ、肺転移病変の臨床的有用率は55.6%となり、これは 「RT なし群」と比較して有意に高い比率（P = 0.016）であることを確認しました。この組み合わせ療法において安全性にも大きな問題は認められなかったことから、 放射線治療を免疫チェックポイント阻害薬の開始前に適用することで、 より良い治療効果が得られる新しい治療法となる可能性があります。本臨床研究の成果は、放射線療法が適用される他のがんにも適用できる可能性があり、免疫チェックポイント阻害薬の適用拡大と併せて検討を進めることでイヌの腫瘍に対するより良い治療の提供に繋がるものと期待されます。

　●　2023年6月2日：イヌ悪性黒色腫に対して放射線治療との併用で抗PD-L1抗体の効果が高まることをはじめて報告 ～イヌ用免疫チェックポイント阻害薬のより良い使用法の実現に期待～

(https://www.hokudai.ac.jp/news/pdf/230602_pr.pdf)

　●　 Combination therapy effective against canine melanoma – Hokkaido University

(https://www.global.hokudai.ac.jp/news/8896)

　さらに、これまで臨床研究の対象としてきた口腔内悪性黒色腫以外の、進行した悪性腫瘍に罹患したイヌ 12 頭に対して、抗PD-L1 抗体の安全性と有効性を調べるための臨床研究を行いました。その結果、鼻腔内腺癌の 1 頭及び骨肉腫の 1 頭で腫瘍の退縮が認められました。

　●　2023年10月5日：イヌの鼻腔内腺癌や骨肉腫に免疫チェックポイント阻害剤が有効であることを初めて報告  ～イヌ用抗PD-L1抗体による免疫療法の適用拡大に期待～

(https://www.hokudai.ac.jp/news/pdf/231005_pr.pdf)

　抗 PD-L1 抗体治療単独での効果は限定的であり、治療効果を高めるための併用療法の開発が求められていることは先述のとおりです。そこで次に、抗 PD-L1 抗体治療に併用する免疫療法薬として、イヌ Cytotoxic T lymphocyte Antigen-4（CTLA-4）に対する阻害抗体（抗 CTLA-4 抗体）を新たに開発しました。そこで抗 PD-L1 抗体単独治療を行ったものの腫瘍の拡大認められたイヌに対して抗 CTLA-4 抗体による併用療法を行いました。その結果、抗腫瘍効果の評価が可能だった 6 頭のうち、1 頭で腫瘍の退縮が認められました。本研究成果は、抗 PD-L1 抗体単独治療に効果を示さなかったイヌにおいても、抗 CTLA-4 抗体との併用治療による免疫療法が有効となる可能性を示しており、イヌ腫瘍に対する新たな免疫療法の実現につながる重要な知見となります。

　●　 2025年5月20日：イヌのがんに抗 CTLA-4抗体治療が有効であることを初めて報告 ～イヌのがんへの免疫療法の適用拡大に期待～

(https://www.hokudai.ac.jp/news/pdf/250520_pr2.pdf)

　これらの研究開発品は，悪性黒色腫をはじめとしたイヌの難治性腫瘍の治療薬として期待できる成果と考えられ、現在も北海道大学動物医療センターにて臨床研究を継続実施中です（図3）。

　●　https://www.vetmed.hokudai.ac.jp/VMTH/aboutus/research/

動物実験は申請後に動物実験委員会等で承認され、実験を実施し、終了報告によって終了するといった一連の流れがあります。終了報告では申請時から逸脱した操作は無かったとか、申請時の使用予定匹数を超過するものではなかったなどの報告をしますが、それらが実際に報告通り行われていたかを知るすべが少ないのが現状です。そこで考えられたのがPAM（承認後モニタリング）という、実験が走っている最中に本当に申請通り行われているかを確かめるための仕組みです。

PAMは通常、動物実験委員会のメンバーや管理獣医師が行いますが、様々なタイプのものがあります。動物実験施設にふらっと入って、その場に居合わせた研究者に軽く質問をしながら何か困ったこと無い？と聞いてやりとりをするのもありますし、実験や手術などに立ち会って最初から最後まで手技についてチェックするのもあります。私は経験がありませんが、事前通告なしの抜き打ちによるPAMも存在するとのことです。

PAMを実施する際には苦痛度の高い試験や、中大動物の大規模手術、PAMを受けた経験のない人を優先して実施するところが多いようです。もちろん動物実験を実施する際には教育訓練を受講してもらいますが、何事もよくある話で、ある一定の割合で内容を理解していない人が必ず出てきます。そう言った意味でもPAMは現場でのセーフティネットの役割を果たしていると考えています。またPAMとセットで多いのが匿名の通報制度です。動物実験をする際に動物虐待があってはなりませんが、疑わしい場合があった際には匿名で通報できるようなシステムを採っています。これらの通報を受けて緊急のPAMを実施することもあります。研究の進捗はもちろん重要ですが、動物の命を扱っている以上、科学的根拠もなしに3Rsや5Freedomsを侵害してはならないからです。

PAMを実施する際には研究員からの反発も予想されますが、こと製薬企業においては品質保証、QA（Quality Assurance）の考えが根付いており、他者からチェックを受けることが日常茶飯事ですので案外スムースに実施できるといった印象です。個人で動くことの多いアカデミアなどではこう上手くはいかないかもしれません。