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遺伝子改変モデル動物の現在と展望

コラム

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ゲノム編集技術の課題

 一方で、ゲノム編集技術によって遺伝子ノックアウト動物を作製する際には、いくつかの課題も存在します(図2)。

図2. ゲノム編集技術の課題と解決のための取り組み

 ゲノムDNAの配列情報が操作されたものがゲノム編集動物であるのに対して、遺伝子ノックアウト動物は対象となる遺伝子が機能的に欠失した動物です。ゲノムDNAの配列情報が操作されているという点で共通しますが、ノックアウトを目指す場合、必ずしも導入された変異が期待通りとは限らないという点に注意が必要です。ゲノム編集では、標的遺伝子の領域に欠失や挿入などの変異をランダムに導入し、翻訳フレームをずらしたり重要なドメインを破壊したりすることで遺伝子機能を失わせます。しかし、導入される変異がランダムであるため、必ずしも期待通りの変異が入るとは限りません。例えば3の倍数の塩基が欠失した場合には翻訳フレームがずれず、タンパク質の機能をそこまで損なわないケースがあります。また、開始コドンを破壊したはずが、下流にある別のメチオニンが新たな開始コドンとして機能してしまい、野生型と同等の機能が保たれる可能性もあります。著者の研究でも、翻訳領域の一部を欠失していても実質的に機能が保たれている例を経験しました。ゲノム編集によって導入される変異のパターンはコントロールするのが難しく、このランダム性がゲノム編集によるノックアウトの効率を制限する要因となっています(図2A)。
 ゲノム編集ツールの標的認識の正確性についても長らくの課題となっていました。ゲノム編集で最も広く利用されているCRISPR/Cas9システムは、DNAを切断するためのCas9タンパク質と、前述の通り標的となるDNA配列を指定するためのgRNAで構成されています。もしもgRNAの指定配列に類似した配列がゲノムの目的の場所の他にも存在する場合、意図せずその部分も破壊してしまう、ということが起きます。これはオフターゲット効果と呼ばれており、ゲノム編集によってノックアウト動物を作製できても、観察される表現型が本来の標的遺伝子の破壊によるものか、それともオフターゲット座位の破壊によるものかどうか、曖昧になるという懸念を生じさせます(図2B)。
 また、ゲノム編集ツールは必ずしもすべての塩基配列を標的として利用できるわけではありません。Casタンパク質はPAMと呼ばれる特定の塩基配列が標的配列の下流に隣接する条件で活性を発揮することが知られています。最も利用されているS. pyogenes由来のCas9は5’-NGG(Nは任意の塩基)という配列をPAMとして必要としています。そのため、標的としたい座位近傍にNGG配列が存在しない場合や、NGGがあってもオフターゲットが生じやすい配列しか選択肢がない場合などは、精度の高いゲノム編集が難しくなります(図2C)。

ゲノム編集技術の高度化のための取り組み

 私たちはこれまで、ゲノム編集技術を利用した遺伝子改変マウス作製の正確性・効率性を高める研究に取り組んできました。例えば、CRISPR/Cas9システムをマウス受精卵に導入するプロトコールを最適化し、全身で変異を持つ遺伝子改変マウス系統の効率的な作出を可能とするとともに、同じ染色体上の2カ所を同時に破壊して大きな領域を欠失させる方法を世界に先駆けて報告しました(図2D)[文献1]。ランダムに短い欠失や挿入を導入するだけでは必ずしも機能破壊に至らない場合がありますが、遺伝子の機能的に重要な部分を大きく削除することで、確実に機能を失わせられる利点があります。この方法を応用し、筋ジストロフィーモデルラットを作製する[文献2]など、ヒト病態を再現するモデル動物の開発に寄与しています。
 一方で、この報告の中で、マウスの受精卵におけるゲノム編集では、その他の培養細胞と同様にオフターゲット変異が導入されうることを明らかにしました。オフターゲット変異は、標的配列と類似した配列がゲノムDNAに存在するために起こります。通常はなるべく似た配列が存在しない座位を標的としますが、遺伝子の限られた場所でゲノム編集を行いたい場合では、選択肢が限られるため、オフターゲットを伴う配列しか標的にできないケースもあります。これに対して、より広範な配列をゲノム編集技術で取り扱えるようにすれば、選択肢が増え、無理のある配列を選ばなくて済むと考えました。そこで、一般的に利用されていたCas9とは異なる生物に由来し、異なる配列をPAMとして認識する新たなCas9を受精卵で利用できるようにすることで、従来ツールでは標的とできない遺伝子へのゲノム編集マウスの作製を可能としました(図2E)[文献3, 4]。また、従来より短いグアニン1つのみが指定されたPAMを利用するCas9変異体を利用し、ゲノム編集マウスの作製が可能であることも報告しました[文献5]。さらには、同じくCas9の変異体のうち、通常のCas9よりも正確に標的の塩基配列を認識することができる方法を応用し、1塩基レベルでの高い精度で標的配列を識別し、ゲノム編集マウスの作製が可能な系を報告しました(図2E)[文献6]。これらの方法は受精卵を介したゲノム編集の高度化に貢献し、正確で効率的な遺伝子改変マウスの作製法として利用されています。
 以上のような取り組みによって、正確で効率的なゲノム編集を可能とし、遺伝子改変モデル動物の作製の効率化を進めています。ノックアウト動物の作製において、著者を含む多くの研究者の研究によって、今や従来法に代わりゲノム編集技術による方法がスタンダードとなっています。ここでは詳細は省略しますが、ノックアウト動物だけでなく、ノックイン動物やトランスジェニック動物の作製に関しても、別の新たな技術の登場により、より簡便で効率的な作製方法が確立されつつあります。今後、ますます遺伝子改変モデル動物の作製は洗練されると期待されます。

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東京大学大学院農学生命科学研究科 獣医学専攻 実験動物学研究室 藤井渉

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米国事情:ミシガン大学

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 幸いにも翌年の平成 3 年(1991)10 月 5 日から 11 月 4 日までの1ヶ月間にわたり国立大学動物実験施設協議会より文部省短期在外研究員旅費で再度アメリカを訪問する機会を得た。この時の訪米目的は「米国における動物実験及び実験動物の現状についての調査研究」というものであり、具体的には「臓器移植関連動物実験、ヒト遺伝子導入トランスジェニック、受精卵凍結保存 の現状調査」に加え、「動物実験施設管理に携わる獣医師の業務及び実験動物専門獣医師の養成制度について調査」するとし、訪問先はミシンガン大学、エール大学、ピッツバーグ大学、バージニア州立大学、国立保健衛生研究所(NIH)およびジャクソン研究所であった。そしていくつか の大学は駆け足訪問ではなく、私一人で 1 週間単位で滞在し、ジックリと米国の各種状況を調査する事を目的とした。帰国後の国動協への報告要旨をもとにその内容を記載する。

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 1993 年(平成 5 年)3 月 31 日開催された実験動物懇話会総会で、当日付けで「実験動物懇話会」 を解消し、翌 4 月 1 日付けで「実験動物医学研究会」を発足させることが決められた。同時に会則も制定し、学会として本格的な体制を整えた。これは日本獣医学会に対して実験動物分科会の設立を求めたことと、同学会へ本会を所属研究団体として認可申請するため、研究団体としてのしっかりとした組織を構築する必要がある事が直接のきっかけである。これが現在の日本実験動物医学会の創立となり、本年 2013 年(平成 25 年)4 月で創立 20 周年となる。手元に前島懇話会 幹事長が作成したと思われる「実験動物医学研究会設立趣旨」なる文章があるが、内容を抜粋要約すると「設立の第一の目的は、獣医学領域で行なわれている研究情報の効率的な収集と流布である。獣医学領域で公表されている研究には実験動物に関するものは解剖学や生理学,薬理学、 病理学、微生物学、臨床学等の領域に分かれて報告されており、実験動物に関係している者には 必ずしも有効な情報となっていない。研究会を設立することにより実験動物医学を中心とした情報の会員間伝達を促進する。第二に、獣医学学生や実験動物専門家に対する教育の質の向上を図る。獣医科大学間の実験動物学教育内容の相違や大学院や卒後教育が不完全である。本研究会で 実験動物医学に重点を置く実験動物に関する教育の充実を目指す。」となっている。

 1994 年(平成 6 年)2 月には JALAM ニュースレター「実験動物医学」を発刊し、年 2 回発行 する機関誌とした。これによると 1994 年(平成 6 年)2 月 7 日付けの日本獣医学会実験動物分科会会員数(実験動物医学研究会会員数)は 237 名と記されている。最新(平成 24 年 3 月)のデー タでも会員数は 265 名とほぼ同じであり、発足当初から実験動物学に興味のある獣医学会会員は直ちに実験動物医学研究会に参加してくれたことになり、その期待の大きさが読み取れる。1994 年(平成 6 年)3 月 31 日には実験動物医学研究会としての第一回総会開催し、同時に第一回教育セミナーを開催した。教育セミナーは教科書的な基本内容とトッピクス的なものについての講演 会を企画することとし、第一回目は講義として有川二郎先生の「実験動物の疾病,人獣共通伝染病—腎症候性出血熱を中心としてー」であり、トッピックスとして松沼尚史先生の「毒性試験における種差」および野々山孝先生の「自然発生病変に及ぼす飼料の影響」であった。

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 研究会は、その体制が確立し活動が軌道に乗ったため 1996 年(平成 8 年)4 月 2 日に総会にて 本会名称を「日本実験動物医学会」と変更した。日本獣医学会理事会で承認されたのは平成 8 年 12 月 6 日である。この 4 月の総会ではいよいよ実験動物医学会の認定制度を具体的に検討するた めに認定制度検討委員会を発足させた。委員長は私が指名され、委員は 8 名で委員会を発足させ た。ここに認定制度の基礎を共に考えていただいた委員のお名前を掲載して、敬意を表したい。 安居院高志、板垣慎一、黒澤努、二宮博義、降矢強、宮嶌宏彰、毛利資郎、八神健一(敬称略)。

 認定制度検討委員会では委員間での議論を通して、認定制度の骨格を考えることはもとより、 総会やシンポジウムを通して、認定制度の必要性について会員間での議論を活発に行なった。ニュースレターNo. 9(1998 年 1 月)に 1997 年 7 月から 10 月の認定制度検討委員会内での議論が報告されている。抜粋して紹介してみる。

「認定制度の会員へのメリットは何か、認定された獣医師の目標や理想像を示すべきである。 ただ、目に見えるメリットが現れるのは 20年先でよいが、その時になって認定された獣医師がその任に相応しくなっていれば、この制度が脚光をあびる。「獣医師」資格をこの認定の前提とすることでよい、しかし認定委員等は獣医師ではない実験動物学講座教授であっても良い。獣医師会との連携が必要である。ウェットハンドの研修会が必要である。制度案をまとめるにあたり、 この制度の意義や目的を明確にした前文を作り、それによりこの制度のイメージが誰にでもわかるようにすることが必要。」

 この議論では、とくに制度設立のメリットを早急に追うことは難しく、10 年後、20 年後の後輩 にメリットが享受できるよう、現在の会員ががんばるという少々悲壮感にも似た意見も見られ、 委員は全員うなずいた。この議論から既に16 年経っており、昨今はようやく少しはメリットが現れていると思うが、専門医は社会の期待に添う実力はついているか、専門医の不断の努力ととも に、専門医協会の制度的な対応も課題となっているように思う。

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今後の課題

 本会も昨年 20 周年を迎え、ようやく軌道に乗って来た感がある。ここで、学会としての今後の課題を一つあげる。我が国では動物実験に関する法律や各種規定、指針には獣医師の必要性や役割が全く記載されていないことがある。動物愛護管理法、実験動物に関する基準、文科省を始め 各省庁の動物実験に関する基本指針のどこにも「獣医師」はもとより「獣医学的管理」という言 葉すら見つけることができない。このようなことは世界の主要な国々ではあり得ない。国際医学団体協議会(CIOMS)が 1985 年に制定し、昨年 2013 年に改正された「医学生物学領域の動物実験に関する国際原則」、世界動物保健機構(OIE)が決定した実験動物福祉条項、そして米国国内の指針ながら国際的に使用されている National Research Council の「実験動物の管理と使用に関する指針(第 8 版)」にはすべて、獣医師の役割や獣医学的管理の重要性が謳われている。近年は アジアの国々にも動物実験に関する法規が整備されて来たが、これらの国々の法規にも獣医師の役割が記載されている。グローバル化を叫ぶ我が国のこうした状況は異常としか言いようがない し、もう一つのガラパゴス化であり、その被害は実験動物が被っている。

 実験動物といえども動物であり、第 3 の家畜という言い方もある。この動物の健康管理はも より、研究者の行う実験における苦痛の軽減や術前術後の健康管理に獣医師が関わるのは当然で あり、動物の福祉を求める国民が強く望んでいることである。もちろんこれまでも我々獣医師は 実験動物の飼育や動物実験の現場はもとより、施設の管理や研究者への教育、さらには動物愛護 管理法や各種指針の制定や改正の節目節目に国や学術会議等が設置した委員会等に多くの獣医師が関わって来たし、大きな役割を果たして来た。しかし、上記で示した「異常な状況」が続いており、現在までも改善できないことは、我が国では獣医師の立場が弱いとか、社会の理解がない などのせいばかりではなく、実験動物界に足場を置いてきた私を含めた獣医師の力や努力も圧倒的に足りなかったと言わざるを得ない。

 我が国のこれからの動物実験を含む研究倫理や動物福祉の観念の高まり認識し、また何よりも 実験動物の立場に立った適正な動物実験のあり方を考えるとき、我が国の法規や指針等の公のル ールで獣医師の役割を明確にすることは喫緊の課題である。社会や各種学会、さらには 5 年毎に行われる動物愛護管理法見直しの議論においても本学会の会員の皆さん、また研究機関や教育機 関で重要な立場を占めるようになっている実験動物医学専門医の皆さんの大いなる努力に期待し たい。

 4 回にわたって「私観・日本実験動物医学会史」として、本学会の歩みを振り返ってみた。こ の日本実験動物医学会の設立に至る過程やその後の活動、そして実験動物医学専門医(認定獣医師)制度の設立とその後の発展過程は、私が 1985 年(昭和 60 年)にこの世界に足を踏み入れて 以来の私の活動の軌跡そのものだったように思う。この間、多くの諸先輩、同僚、そして現在第 一線で活躍されている後輩の皆さんと活動を共にできて、大変楽しかったし、充実した活動ができた。この場をお借りしてお礼を述べて、筆を置く。

2014 年 2 月節分

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JALAM会員の寄稿