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非アルコール性脂肪性肝疾患のモデルマウス

 糖質を増加させることもNAFLD/NASHの発症や進行に影響を与えます。特に過剰なフルクトースはマウスの肝臓に深刻な障害をもたらします[3]。腸管で吸収されたフルクトースは殆どが肝臓で取り込まれアセチルCoAに変換されます。合成されたアセチルCoAはクエン酸回路を介してATP合成に使用されますが、余剰分については脂質合成に用いられることで脂肪肝の原因となります[5]。また腸管においては、フルクトースは腸内細菌叢の異常な増殖を促すことで、門脈を通じて肝臓に流入するバクテリア由来のエンドトキシン量を増やします[3]。結果的にクッパー細胞をはじめとした肝臓内の免疫細胞が活性化され、肝炎の原因となると考えられています。初期の研究でフルクトースとグルコース(以上単糖類)、ショ糖(二糖類)を自由給餌させたマウスではフルクトースが最も肝臓への傷害が大きいことが示されましたが、その後の研究で、フルクトース単独給餌よりグルコースとの混合液の方が腸でのフルクトースの取り込みが促進され、障害が大きくなるという知見もあります[5]。

 肝臓は中性脂肪をVLDL(超低密度リポタンパク質)の形で血液中に放出します。VLDLの放出にはVLDLを構成する主要リン脂質であるホスファチジルコリンが必須であることから、その材料となるメチオニンやコリンは肝臓からの脂質の排泄に不可欠といえます。そこでメチオニンやコリンを欠損させた餌(MCD)を与えることで肝臓に脂質を滞留させることも、NAFLD/NASHを誘導させるために古くから使用される手法です[10]。この方法の欠点は、メチオニンの欠損が肝臓以外の部位にも悪影響を与えることです[16]。事実、MCD給餌マウスでは、顕著な筋重量の減少が知られています。従って純粋に肝臓の異常に起因する変化を解析したいときには不向きなモデルといえます。

 一方、コリン欠乏L-アミノ酸添加飼料(CDAA)モデルもNAFLD/NASHの誘導に広く用いられます。この動物モデルでも、脂肪肝、肝細胞傷害、肝線維化、さらに肝がんの発症が認められますが、体重や肝重量、インスリン感受性などは通常飼育下のマウスと大差ないので、ヒトのNAFLD/NASH病態とは異なる部分があると考えられます[14]。このモデルはラットでは劇的な肝障害をもたらしますが、マウスでは障害作用が限定的であり、実験個体によっては全く障害がみられないこともあることから[16]、個体数削減を考えるうえでは推奨できません。

 このように食餌性NAFLD/NASH誘導モデルには様々な長所・短所が知られていますが、時間をかければ高脂肪餌給餌によって、最終的にマウスに高い確率で肝障害をもたらします。中外製薬の松本らは、この点に着眼しました。彼らはCDAAと高脂肪餌を組み合わせた、コリン欠乏0.1%メチオニン添加高脂肪飼料(CDAHFD)によるNASH誘導モデルを考案しました[13]。CDAHFDを3週間給餌したC57BL/6マウスはCDAA給餌マウスモデルと異なり明らかな肝肥大が認められました[13] (図1)。このモデルでは給餌開始1週間後より脂肪肝の組織像が認められ、血中ALT値が増加します[13]。さらに給餌6週目には高率に肝線維化が認められます[13]。このようなことから、CDAHFDは現在、広くNAFLD/NASH誘導モデルに使用されています。

図1.通常餌またはCDAHFDを4週間給餌したマウスの肝臓の肉眼所見

 CDAHFD(コリン欠乏0.1%メチオニン添加高脂肪飼料、本文参照)を給餌したマウスの肝臓は脂肪肝に伴う臓器色の変化と腫大が認められる。

コラム

ミネラル調節ホルモン「スタニオカルシン-1」:変わらずに変わった変わり者?

II. スタニオカルシン(Stanniocalcin;STC)-1とは?

上で述べた通り、魚類、特に海水魚は、水中から流入した過剰なカルシウムを鰓や腸から排泄します。硬骨魚類には、腎臓にスタニウス小体とよばれる器官が存在しますが、そこから分泌されるスタニオカルシン-1(以下STC1)というホルモンが、血中カルシウム濃度を「下げる」役割を担っています [1, 2](図2)。実際に、スタニウス小体を除去した魚類は高カルシウム血症を呈することが報告されています [3]。また、淡水魚であるコイ類はスタニウス小体が2個であるのに対し、淡水海水両方で生育できるサケ科魚類はスタニウス小体が4個あります。このことからも、STC1が血中カルシウム濃度の維持に重要なホルモンであることが想像できます。一方、哺乳類においては、主に上皮小体ホルモン(PTH)や活性化ビタミンDが血中カルシウム濃度を「上げる」役割を担っています。加えて、血中カルシウム濃度を「下げる」ホルモンとしてカルシトニンが存在します。以上から、哺乳類ではSTC1は、本来の役割を終えて退化していても不思議ではありません。ところが驚くべきことに、魚類から哺乳類まで、幅広くSTC1が保存されています(図3)。このことから、STC1は生体にとって何らかの重要な役割を担っていることが予想されましたが、STC1遺伝子のノックアウトマウスには一切の異常な表現型が見られません [4]。一方で、STC1を全身に過剰発現させたトランスジェニックマウスは、矮小(dwarf)になり、筋肉内のミトコンドリアが肥大化し、エネルギー浪費型となることが報告されています [5]。この報告から、哺乳類では、STC1がミトコンドリアに何らかの作用を有することが予想されますが、その全体像は未だによくわかっていません。

コラム

動物福祉の評価ツールのご紹介-3 福祉を評価するツールを紹介するサイト2: NC3Rsの Welfare Assessment

1.福祉指標の策定

このガイドラインは福祉指標として着目すべき事柄を以下の6つのカテゴリーに分けています。詳細については、欧州委員会の「苦痛度評価の枠組みに関する作業文書」の13ページ下から始まる表“Appearance / Body Functions / Environment / Behaviours / Procedure-specific indicators / Free observations”を引用する建付けになっています。動物の状態のチェックリストとして使うと考えると、この表で十分ではないかと思います。

●身体、被毛、皮膚の状態を含む外見(例:身繕い行動の低下、ラットのポルフィリン着色)

●身体機能(例:摂餌・摂水量の減少、体温の変化など)

●ケージやペンなど内の環境(例:巣の質、排せつの場所など)

●行動(社会的相互作用、姿勢、歩行、常同行動のような望ましくない行動など)

●実験方法特有の指標(例:がん研究における腫瘍の大きさなど)

●自由観察(観察者が予測しなかった苦痛の指標を見た場合、自由にテキストを入力できるようにする)

福祉指標の策定の進め方は以下のように記載されています。

●最初に、各手技に適した福祉指標を具体的に定義する。

●「手順全体を検討」し、「発生しうる苦痛の種類と原因を特定」することから始める。

●「肉体的苦痛」だけでなく、「不安や苦痛」、「科学的処置の直接的影響」、さらに「取り扱いや拘束、あらゆる飼育上の制限」、「安楽死の影響」なども検討する。

●体重などの「客観的基準」と、被毛の状態、姿勢、社会的行動などの「主観的指標」を組み合わせる。

●「重大な苦痛を示す指標(毛玉など)」ばかりに注目するべきではない。また、「劣悪な福祉状況を早期に発見できるような指標(巣の状態の悪化など)」も含める。

●マウスの開腹手術後の苦痛の状態について「術後に鎮痛処置を施さなかった場合、鎮痛処置を施した場合と異なり、心拍数の上昇などが24時間認められ、体重と摂餌量の減少が2・3日続いた」と報告1)されている。

●「指標の数」は、苦痛の兆候を確実に検出するのに十分で、かつ、有能な観察者がその動物を自由に評価できる「設定時間内で観察可能なもの」とする。

●福祉状況記録用紙に「自由記述欄」を設け、追加観察事項を記録可能とする。

●観察のタイミングと頻度は、動物の通常の活動パターン、科学的処置のタイミング、起こりうる苦痛のレベルなどを考慮する。例えば、ラットやマウスは夜行性なので、観察を動物が眠っているはずの明るい時間帯(人間の労働時間)だけに限定すると、重要な行動指標を見逃す可能性がある。同様に、術後や疾患の経過における重要な時期など、有害事象が発生しやすい時期には、より頻繁に評価を行う必要がある。

コラム

動物福祉の評価ツールのご紹介-2
〜福祉を評価するツールを紹介するサイト1:USDAのNational Agricultural Library〜

Welfare Assessment Training and Resources動物福祉の評価のトレーニングとリソース

1)”CCAC Guidelines: Animal Welfare Assessment

 カナダ動物愛護協議会(CCAC, Canadian Council on Animal Care)が2021年に作成したガイドラインへのリンクです。このガイドは、なぜ福祉を評価するのか、福祉指標を特定し、福祉評価の文書化について説明しています。このガイドラインの要点を、極端に短くまとめれば、以下の5点に集約できます。

 ・評価の監督は委員会が担うが、評価そのものは評価実施者に任せる

 ・動物は健康であるべき

 ・福祉評価は定期的に実施する

 ・評価に用いた情報は研究者などが利用できるよう記録する

 ・評価の結果を動物実験委員会は利用する

2)“Welfare Assessment

 “動物実験の3Rsの推進”を図る、英国NC3Rs(The National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research)が作成した“Welfare Assessment”ガイドにリンクしています。このガイドでは、以下の情報を提供しています。

 ・福祉指標の特定

 ・実際上の侵襲性の評価と報告

 ・効果的な記録の保持とレビュー

 ・スタッフのトレーニング

 ・関連リソース

3)“Guide to Welfare Assessment Protocols

 苦痛の軽減(Refinement)に関する英国合同ワーキンググループ(JWGR)が2011年、Laboratory Animals誌に発表した“A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement へのリンクです。このガイドには、動物の苦痛の軽減に関する事項がかなり細かく記載されています。

 ・効果的な福祉評価スキームのための一般原則

 ・チームアプローチ

 ・良好な福祉の定義

 ・適切な福祉指標の選択

 ・動物福祉指標の記録システム

 ・評価のタイミング・期間・頻度

 ・実践的な福祉評価(観察・潜在的な福祉問題の指摘)

 ・福祉記録の確認

 ・倫理・動物愛護委員会との連携

 ・さらなる情報へのアクセス

コラム

動物福祉の評価ツールのご紹介-1
〜AVMA主催の“学生動物福祉状況の評価コンテスト”〜

 さて、イリノイ大のニュースによると、このコンテストの目的は、「農業、研究、伴侶など、人間のために使用される動物に影響を与える福祉問題の理解と認識を高めるための教育ツールを経験することであり、倫理的推論に対する理解の上に、科学的理論とデータに基づいた動物福祉の客観的評価を促し、批判的思考を促進し、コミュニケーション能力を向上させる」ことです。参加対象は、3・4年学部生、獣医学部生、院生(1チーム3-5人)であり、動物看護師やAVMA会員の獣医師も少数に限り参加できます(ただし、コンテストの対象外)。参加者はいくつかのシナリオに沿って出題される動物とその福祉状況を分析して、その中から優れたシナリオを選び出し、発表するというものです。

 ニュースでは、“動物福祉のさまざまな事象をそのときどきの断片として客観的かつ定量的に評価することも可能ですが、福祉問題は連続したものであり、どのあたりで許容できるか、どのあたりが好ましいか、または許容できないかの判断は、多くの場合、倫理に基づく選択に帰着するものです。コンテストでは、問題解決へ学際的にアプローチするため、科学に基づく知識を倫理的価値観と統合することを学生に教えています”という風に審査の方法について説明しています。私たちが学生の動物福祉評価を審査するのであれば、北米でどのような基準やチェック方法に従って動物福祉が評価されているのかの具体例を知りたいところです。

 今回はこのくらいにさせていただいて、次は、動物福祉評価のツールについて整理していきたいと思います。

参考文献

1) Beaver B. V. and Bayne K, Chapter 4 – Animal Welfare Assessment Considerations, Laboratory Animal Welfare, 29-38 (2014)

2) Animal welfare judging team provides unique experiential learning for students. (cited 2022. Oct.28)

3) AVMA Animal Welfare Assessment Contest. (cited 2022. Dec. 05)

コラム

実験動物の飼育環境

 まず、実験動物に対する動物福祉の観点から、環境省の基準に疾病予防が義務付けられており(1,2)、SPF環境での飼育はその一つとなります。また、実験に用いた動物が病原性微生物に感染していた場合、実験成績に影響を及ぼし、再現性のある正しい実験結果を得ることが出来なくなってしまうことも重要なポイントです。加えて、ヒトがん研究や、再生医療・幹細胞研究において、動物にヒト細胞の移植実験を行う際、レシピエント(移植を受ける側)には重度免疫不全動物が必要になります。このような免疫不全動物を飼育するためには、高度にクリーンな環境が必須となる訳です。

 このような事情から、医学系の動物実験施設では大変なコストを掛けながらも基本的にSPF環境で動物を飼育しています。ちなみに、我が国における実験動物のSPF化には、前述の実験動物中央研究所の創設者である野村達次先生が多大な貢献をしており、1962年に川崎市野川にSPF動物生産施設を作り、SPFマウスの種親を米国より輸入して、野川でSPFマウスの生産を開始したそうです(3)

2. 実験モデルと飼育環境

 ところで、ヒトの疾患を考えた場合、クリーン動物の結果は必ずしも適切でない(クリーンな飼育環境では病態を反映できない)ことがあります。私たちの研究グループが経験した事例をご紹介したいと思います。

 私がかつて東大医科研に所属していた際、特定の糖鎖を認識する自然免疫受容体の一群であるC型レクチン受容体ファミリー分子の研究プロジェクトに参画していました。この中で、デクチン1というカビの細胞壁構成成分の一つであるβグルカンのセンサー分子をコードする遺伝子Clec7aを欠損させたマウス(Clec7a KOマウス)を用いて、デクチン1の免疫応答における役割の解明に関する研究を行なっていました。私たちは、研究所のSPF環境で飼育しているClec7a KOマウスを用いて大腸炎発症におけるデクチン1の役割を調べました。マウスにデキストラン硫酸ナトリウム塩(DSS)含有水を与えて飼育するだけで、ヒトの潰瘍性大腸炎に類似した急性の大腸炎を誘発することが出来る方法があり、ヒト潰瘍性大腸炎の疾患モデルとして広く使われています。私たちがClec7a KOマウスにDSSを投与して誘導大腸炎を誘発すると、対照の正常マウスと比較して大腸炎がとても軽症となっていることがわかりました。そこでこの結果をまとめて発表しようとしていたところ、Cedars-Sinai Medical Center(アメリカ)の研究グループからClec7a KOマウスにDSS誘導大腸炎を行うと増悪化するという真逆の研究結果が報告されました。ヒトの薬物療法不応答潰瘍性大腸炎(MRUC)患者はCLEC7A遺伝子座に存在する2つの一塩基多型(SNP)ハプロタイプと相関があるという結果と併せての説得力のある研究成果であり、トップジャーナル“Science”誌に掲載されました(4)。ではなぜ、私たちの研究グループと正反対の結果となっていたのでしょうか。

コラム

理研マウスENUミュータジェネシスプロジェクトを利用したフォワードジェネティクス研究

1. 変形性関節症モデル : M451マウス

 はじめに同定した M451マウスは常染色体顕性(優性)形式で短指症を呈するマウスで3)、連鎖解析によって原因遺伝子は第2染色体上にマップされました。この領域には自然発症短指症マウス(bpマウス)の原因遺伝子であるGdf5が存在しており4)、予想通りにM451マウスのGdf5遺伝子にはp.Trp408Arg(408番目のTrpがArgに置換される)ミスセンス変異が同定されました。bpマウス以外にも、Gdf5変異によって短指症を発症するマウスは報告されており、科学的価値があまり高くない結果に落ち着きそうだと落胆していたのですが、研究は急展開していきました。

 私は当時、池川志郎先生が率いる理研生命医科学研究センター・骨関節疾患研究チームに所属していたのですが、池川先生らはヒトGDF5遺伝子上の一塩基多型(SNP)が変形性関節症(OA)の疾患感受性と関連していることを報告していました5)。OAは関節軟骨の変性や消失を特徴とし、疼痛や歩行障害が生じる疾患です。OAの発症には複数の遺伝要因と複数の環境要因がかかわっており、多因子疾患に分類されます。OAの発症にかかわるSNP(+104 T/C)はGDF5遺伝子のプロモーター上に存在し、OA患者が多く持つ+104Tアレルを持つプロモーターの活性は、健常者が多く持つ+104Cアレルを持つプロモーター活性よりも有意に低下します。つまり+104Tアレルを持つとGDF5産生量が低下し、OAに罹患しやすくなると考えられます。そこで、私たちはp.Trp408Arg変異をホモ接合でもつM451マウスの関節を調べた結果、肘関節の関節軟骨にOAと類似した病変が確認されました(図1A)3)。p.Trp408Arg変異は優性阻害を引き起こす強い変異効果を持っており(図1B)、この一種類の変異だけでOA様の病変が誘発されます。

 M451マウスの研究から、マウス遺伝学からもGDF5がOAの感受性遺伝子であることが証明されました。GDF5の機能異常がOAを引き起こすメカニズムは、まだよくわかっていません。GDF5はBMPスーパーファミリーに属する成長因子で胎生期の関節形成に関わっていることから6)、+104 Tアレルを持つヒトは、OAになりやすい構造的な関節の異常を持っているのかもしれません 。これはX線解析などでは判別できないわずかな異常で、加齢に伴い徐々にOA病変が発現してくると考えられます。またGDF5は関節の恒常性維持に関わっているという報告もありますので、+104 Tアレルを持つヒトでは、この維持機構にわずかな異常が生じているのかもしれません。M451マウスはGDF5とOAの関連を調べるためのよいモデル動物です。

コラム