3. 遺伝子ヒト化マウス

　モデル動物を用いた遺伝性疾患の研究において最も大きな障害は、当然のことですが「動物はヒトではない」ということです。動物はヒトと同じ遺伝子配列を持っていません。すなわち、ゲノム編集やエクソン・スキッピングなどのヒト遺伝子特有の「塩基配列」を標的とする治療法の開発には、種特有の遺伝子しか持たない疾患モデル動物は使用できないことになります。したがって、上述したモデル動物での治療実験は全て「コンセプト」の実証であり、他の医薬品のようにヒト患者に投与するための製剤を動物で試験することができない、という大きな課題があります。このような課題を克服する手段として、ヒト遺伝子を持つトランスジェニックマウス(遺伝子ヒト化マウス)が近年注目されています(16)。

　DMD研究分野では、ヒトの全長DMD遺伝子を持つマウス(hDMDマウス)が2004年にオランダのライデン大学のグループによって報告されてます(17)。このhDMDマウスは全身にヒトDMD mRNAを発現するため、ヒトDMD遺伝子を標的とするASOが生体内でエクソン・スキッピングを誘導可能かを評価できるモデルとして登場しました。しかし、このhDMDマウスには二つの問題点があります。一つ目は、ヒトDMD遺伝子を標的とするASOがマウスDmd遺伝子と交差反応し、適切な評価が妨げられる可能性です。この問題に対しては、hDMDマウスとDmd遺伝子全体が除去されたトランスジェニックマウス(Dmd-nullマウス)の交配により作製されたhDMD/Dmd-nullマウスが一つの解決案として報告されています(18)。二つ目の問題として、導入されたhDMD遺伝子は正常な遺伝子であるため、変異DMD遺伝子に対する有効性を評価できないことが挙げられます。本問題の解決案として、ゲノム編集技術を用いてヒトDMD遺伝子に患者と類似の欠失変異が導入されたhDMD^delマウスが報告されています(19)。このhDMD^delマウスはmdxマウスとの交配により、マウス由来のジストロフィンを発現しないhDMD^del/mdxマウスとして治療研究に利用されています。このようにいくつかのhDMDマウスの種類が報告されていますが、変異hDMD遺伝子が直接的な原因となり骨格筋病態を再現するモデルはまだ確立されていません。ヒト変異DMD遺伝子を標的とする治療薬の生体における有効性をより適切に評価するためには、例えばhDMD^del/Dmd-nullマウスのような、上記の問題を克服できるモデル動物の開発が今後必要になると考えられます。

　その後リトルは、1922年に何と33歳の若さでメイン大学（University of Maine：米国メイン州の州立大学）の学長に就任しました。リトルは学長になっても研究を続け、同州の観光地であるバーハーバー（Bar harbor）にマウスの実験室を作り、夏休みにはここで研究を行いました。1925年からはミシガン大学（University of Michigan：米国ミシガン州の州立大学）の学長に就任しましたが、バーハーバーでの研究に専念するために1929年にミシガンを去りました。リトルが大学を離れてバーハーバーで研究に専念出来るための資金援助を行った一人が、ミシガン州デトロイトの自動車メーカー・ハドソンモーターカンパニー（Hudson Motor Company）の当時の責任者であったジャクソン（Roscoe B. Jackson）だったそうです（ジャクソン研究所のホームページより）。米国では、大学の建物、研究所や病院などを設立する際にその資金提供者の名前を組織名や建物名に冠することが良くありますが、リトルも資金援助者であるジャクソンに敬意を示してバーハーバーの研究所にJackson Memorial Laboratory（ジャクソン記念研究所）という名前を付けました。これが、教科書などで説明されている「リトルは1929年にマウスの研究開発と系統保存を行うジャクソン研究所を設立した」の起源となるのです。

　リトルの研究業績についてもう少しだけ触れたいと思います。前述したように、リトルの腫瘍に関する研究はジャクソン記念研究所の設立以前から始まっています。リトルは、F1、F2とマウスの世代が進むにつれて移植した腫瘍の生着率が低くなることに気が付きました。そして、同種異個体からの移植組織の生着性を決定しているは遺伝子であると主張しました（これが、後の主要組織適合遺伝子複合体の発見に結びつきます）。これらの研究は1914年から1916年にかけて行われ、その後、非悪性組織の移植に関する研究論文も発表しています[4]。リトル自身による移植に関する研究は1924年（36歳）の時点で終わりますが、リトルの腫瘍および移植に関する研究が大きな背景となり、実験動物の遺伝的均一性の重要性が生まれ、それがジャクソン研究所の設立につながり、その後の多様な“近交系”実験動物の系統開発・維持に繋がるわけです。

リホーミングは実験動物の余生を考える素晴らしい方法ではありますし、著者らもリホーミングを推奨してはいますが、この文献では課題として憂慮されるプロセスも赤裸々に示されており、安易に進めることがまた新たな問題を生じさせてしまう可能性も示唆されます。リホーミングにおいては各動物種に最適な方法を慎重に選択することが必要でしょう。ある意味リホーミングではなくとも、残された1頭のように、実験施設や研究者自身が最初の飼養者としての責任を持ち、アニマルサンクチュアリのように実験施設や自宅での終生飼育を考えるといったことも実験動物の余生を考える選択肢の一つとなるようにも思います。

また 大変興味深いことに、今回リホーミングの対象となった認知研究について、著者らはビーグルを用いて実施していた実験法を家庭犬に用いることで、その後実験用ビーグルの必要性がなくなったと報告していました。動物実験とは通常実験動物を用いて行われるものではありますが、実験法を確立した後の実験には実験動物が必要なくなったということです。こうした動物実験の代替の可能性もあるのかもしれません。

もちろん研究対象は目的に拠るものですが、実際に動物用医薬品の開発でも医薬品の開発でも、ボランティアによる治験や臨床試験が行われます。動物実験とは実験動物を用いて実験をするという側面だけではなく、動物のことを研究して理解を深めてゆくことでもあります。動物の余生についても研究を重ね、多様な選択肢の中で考えを巡らせてみることは、改めて社会として適切な動物実験を実施するとは何かということを考える材料にもなるかもしれません。

　以上、C57BL/6JとC57BL/6Nの遺伝子型・表現型の違いについて簡単にご紹介致しました。C57BL/6JとC57BL/6Nはともに多くの亜系統があり、それぞれのグループの間に遺伝子型、表現型の違いが見られることがあります。C57BL/6JとC57BL/6Nは非常に多くの動物実験に使用されており、遺伝子改変動物の作製にも頻繁に利用されています。由来も同一で系統名もほとんど同じマウスですので、2つの系統を混同してしまうことが起こり得るかと思います。コントロール（野生型）マウスとして異なる亜系統のマウスを使用してしまい、そのことが結果として研究の結論にまで影響を及ぼす可能性があることなどは、頭の片隅に置いておいても良いのではないかと思います。また、過去の研究報告と自らの実験成績を比較･検討する際にも、用いた実験動物の系統については十分注意する必要があるでしょう。本webサイトのコラムに動物研究の報告のための指針である「ARRIVEガイドライン」に関する記事が掲載されております。ARRIVEガイドラインでは、実験動物の種･系統・亜系統･性別･年齢･体重などの情報を研究報告に記載することが推奨されております（項目8：実験動物）。用いた実験動物の詳細を明示しておくことは、研究データの有益性や利用性を向上させ、世界中の多くの研究者にとって多大な利益につながることが期待されることでしょう。

　（本コラムの引用文献、図は、クリエイティブコモンズライセンスの下に提供されています。）

参考文献

[1] Russell ES. Genetic origins and some research used of C57BL/6, DBA/2, and B6D2F1 mice. in: Gibson DC, Adelman RC, Finch C. editors. Development of the rodent as a model system of aging. Bethesda: DHEW Publ No. (NIH) 79–161; 1978. pp. 37–44.

[2] Mekada K and Yoshiki A. Substrains matter in phenotyping of C57BL/6 mice. Exp Anim. 2021. 70:145-160. doi: 10.1538/expanim.20-0158.

[3] Mekada K, Hirose M, Murakami A, Yoshiki A. Development of SNP markers for C57BL/6N-derived mouse inbred strains. Exp Anim. 2015. 64: 91–100. doi: 10.1538/expanim.14-0061.

[4] Huang TT, Naeemuddin M, Elchuri S, Yamaguchi M, Kozy HM, Carlson EJ, Epstein CJ. Genetic modifiers of the phenotype of mice deficient in mitochondrial superoxide dismutase. Hum. Mol. Genet. 2006. 15: 1187–1194. doi: 10.1093/hmg/ddl034.

[5] Bourdi M, Korrapati MC, Chakraborty M, Yee SB, Pohl LR. Protective role of c-Jun N-terminal kinase 2 in acetaminophen-induced liver injury. Biochem Biophys Res Commun. 2008. 374(1):6-10. doi: 10.1016/j.bbrc.2008.06.065.

[6] Nakagawa H, Maeda S, Hikiba Y, Ohmae T, Shibata W, Yanai A, Sakamoto K, Ogura K, Noguchi T, Karin M, Ichijo H, Omata M. Deletion of apoptosis signal-regulating kinase 1 attenuates acetaminophen-induced liver injury by inhibiting c-Jun N-terminal kinase activation. Gastroenterology. 2008. 135(4):1311-21. doi: 10.1053/j.gastro.2008.07.006.

[7] Bourdi M, Davies JS, Pohl LR. Mispairing C57BL/6 substrains of genetically engineered mice and wild-type controls can lead to confounding results as it did in studies of JNK2 in acetaminophen and concanavalin A liver injury. Chem Res Toxicol. 2011. 24(6):794-6. doi: 10.1021/tx200143x.

実験動物の教科書には、実験用マウスの標準的な飼育室温は20~26℃と記載されています。一方、体温維持にエネルギーを使用しないマウスのサーモニュートラルゾーンは、30℃前後と言われています。室温がマウスの表現型に及ぼす影響を示した文献を紹介し、実験用マウスは何℃で飼育するのが最適なのかを､多面的に考えていきます。

文献紹介：非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）のモデルとしてのマウス -サーモニュートラル飼育により、性差のない悪化した病態を再現できる

Giles, D., Moreno-Fernandez, M., Stankiewicz, T. et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. 

Nat Med 23, 829–838 (2017). https://doi.org/10.1038/nm.4346

（概要）

　非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）は、肝硬変や肝細胞癌の前兆として知られている、世界的に最も一般的で重要なヒトの慢性肝疾患です。ヒトのNAFLDの病態を再現できるモデル動物を用いることで治療法の開発が可能になります。ところが、広く実験動物として利用されているマウスを用いた場合、高脂肪食給餌などの方法でNAFLDの症状が現れるものの、症状に性差が見られ、肝線維化の進行が制限されるなど、ヒトのNAFLDとは異なる病態を示すそうです。

　実験用マウスの標準的な飼育室温(TS)は20~26℃です（ILAR Guide）。一方、マウスが基礎代謝によって体温を維持できる室温、すなわちサーモニュートラルゾーン(TN)は30~32℃です。マウスをTN条件で飼育すると、寒冷ストレスが緩和され、カテコールアミンやコルチコステロイドの産生量が低下します。また、LPS投与による発熱反応が増強されます。すなわち「代謝」と「炎症」の両方に影響を及ぼします。そこで、著者らはTN飼育によって、より「ヒトに近い」NAFLDのマウスモデルを開発できるのではないかと考え、研究を行いました。

　実験の結果、TN飼育したマウスはTSと比較して、高脂肪食給餌による肝重量の増加、および肝脂肪症が悪化しており、肝臓のケモカイン発現、マクロファージの肝臓への浸潤、細菌の肝臓への移動が顕著に悪化したとのことです。また、ヒトNAFLD患者に類似した腸内細菌叢の変化、特にグラム陰性菌の拡大が見られました。さらにTlr4^fl/flマウスとVav1-Creマウスを用いることにより、TN飼育と高脂肪食給餌によるNAFLDの病態進行に、造血系細胞のTLR4シグナルが関与していることが明らかになりました。TN飼育の肥満IL-17軸欠損マウス（Il17ra^-/-およびIl17a^-/-）は、TN飼育の野生型対照マウスと比較して、耐糖能異常、肝重量および肝細胞障害の悪化から免れました。一方、TN飼育と高脂肪食給餌により、C57BL/6では肝線維化は見られませんでしたが、AKRマウスでは肝線維化が誘導されたそうです。また、雄マウスのみならず雌マウスにもNAFLD様病態の徴候が見られました。以上のことから、TN飼育＋高脂肪食給餌によるNAFLDの発症マウスは、免疫反応、代謝応答、腸内細菌叢の変化を伴う、より「ヒトに近い」新しい疾患モデルであることが明らかになりました。

【コメント】

　論文中のコメントにもありましたが、ヒトの場合、先進国では住居内の温度調節機能を利用して、一日の大半を中温域で過ごす傾向にあり、さらに着衣等も考慮に入れるとサーモニュートラルに近い環境で過ごしていると考えられます。遺伝子型だけでなく、飼育温度などの環境的要因を工夫することで表現型の変動をもたらし、ヒト疾患モデルを作出することができた点は、医学生物学の観点のみならず、実験動物学の観点からも興味深いと感じました。

（本コラムの引用文献は、クリエイティブコモンズライセンスの下に提供されています。）

マウスへの気管挿管

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今野兼次郎先生（国立循環器病研究センター研究所）