３．遺伝的なNAFLD/NASHモデル

　遺伝的NAFLDモデルとしては食欲抑制に関係するペプチドホルモンであるレプチンを欠損したob/obマウスが有名です。ob/obマウスは重度のインスリン抵抗性になり、脂質が脂肪組織のみならず肝臓にも蓄積します[8]。しかしながら、肝臓での炎症は起こりづらく、MCDを与えても肝臓の線維化はほとんど認められません[14]。一方でレプチン受容体を欠損するdb/dbマウスはMCDを与えると肝臓の線維化が認められるので[14]、NAFLD/NASHに関せば、ob/obマウスとdb/dbマウスは異なるモデルと言えます。db/dbマウスは鉄の過剰摂取でも肝細胞の空胞変性や、白血球の肝臓への浸潤、肝臓での酸化ストレスの蓄積、肝線維化がみられることが知られています[14]。

　レプチンが視床下部のプロオピオメラノコルチン産生ニューロンに結合すると、このニューロンはα-MSHというホルモンを分泌します[15]。このホルモンは視床下部のメラノコルチン4受容体（MC4R）に結合しエネルギー貯蔵を抑える働きがあります[15]。逆にこの受容体をコードするMc4r遺伝子を欠損したマウスは通常餌を与えた環境でも過食やインスリン抵抗性を示し、高脂肪餌を与えると脂肪肝や肝炎、肝線維化といったNAFLD/NASHの病態を示すことが知られています[15]。Mc4r遺伝子欠損マウスの肝病態は高脂肪餌を与えるとより顕著で、給餌開始8週目で肝炎像が認められ、16-24週目には肝線維化が生じ、48週目以後には肝臓がんも発症します[7]。

　ステロール調節エレメント結合タンパク質（sterol regulatory element-binding protein, SREBP）は遊離脂肪酸やコレステロール合成に関わる遺伝子の発現を調節する転写因子です[4]。SREBPファミリーの一つであるSREBP-1cを肝細胞で強制発現させたトランスジェニックマウスは、内臓脂肪の蓄積や血中脂質の増加に併せて、脂肪肝になることが知られています。しかしながらヒトと異なり体脂肪量はむしろ減少します[18]。一方で、脂肪組織でSREBP-1cを強制発現させるモデルも用いられることがあります。このモデルの場合、先天的な脂肪組織の分化異常があり、結果、重度な2型糖尿病を呈します[8]。これに伴い肝臓においても、通常餌の給餌で20週齢ごろには肝臓の空胞化、肝炎、肝線維化などNASHの病態を示します[8]。

　Alström症候群は小児期に2型糖尿病を発症しやすい疾患です[6]。Alström症候群は中心体タンパク質であるALMS1をコードするALMS1遺伝子の変異が原因とされます[6]。マウスではALMS1遺伝子のオルソログに変異をもつfoz/foz マウスが知られています。foz/fozマウスに高脂肪餌を給餌すると、インスリン抵抗性や脂肪肝に加えて、肝線維化を生ずることが報告されています[2, 12]。

　筑波大学の秋山や蕨らはp62とNrf2の2つの遺伝子を欠損したダブルノックアウトマウスは、通常の飼育環境化で飼育するだけで、30週齢には顕著な脂肪肝になり、白血球の浸潤や線維化も認められることを報告しました[1]。このマウスは50週齢になると10%の割合で肝臓がんを発症することから[1]、ヒトのNASHに似た病態を示すと考えられます。

　NASHの病態を調べるうえで一つの問題点は、疾患モデルマウスを作成するのに要する時間です。短期間でNASHを発症するモデルマウスの構築も大きな課題です。筑波大学の濱田らは毛色を決めるチロシナーゼ遺伝子を欠損させたB6（Cg）-Tyr^c-2J/Jマウス（以下Tyr欠損マウス）に高コレステロール餌を給餌するとわずか3日で脂肪肝、白血球の浸潤、肝臓の線維化がみられることを報告しました[11]。これは、Tyr欠損マウスの腸ではコレステロール吸収が高まっていることが原因と考えられます。事実、高コレステロール餌を給餌すると、野生型のC57BL/6マウスと比べて、Tyr欠損マウスの血中の総コレステロール、カイロミクロン、VLDL、LDL値がいずれも増加することが示されました[11]。

・ウサギ・マウス結紮腸管ループ試験

　本試験では、動物を一定期間絶食させた後、麻酔下で開腹し、小腸に両端を結紮した腸管ループを複数作成します。ループ内に試験液を投与した後、小腸を腹腔内に戻し、腹壁を縫合します。数時間後に再度開腹し、ループ内に液体の貯留が認められたものを陽性とします。本試験法は、1990年版には、ウサギの結紮腸管ループ試験が毒素原性大腸菌の易熱性エンテロトキシンの検出法として、ウサギ、マウスの結紮腸管ループ試験がセレウス菌の下痢原性毒素の検出法として掲載されています。2004年版と2018年版には、マウスの結紮腸管ループ試験がセレウス菌の下痢原性毒素の検出法として掲載されています。

・乳のみマウス法

　本試験では、生後2〜5日の乳のみマウスの胃内に試験液を投与し、腸管内の液体貯留量を測定します。試験液の投与は、注射器の先に1cmほどの長さのポリエチレンチューブを使って経口的に行いますが、注射器で直接経皮的に胃内投与する方法もあります。1990年版にのみ、毒素原性大腸菌の易熱性エンテロトキシンの検出法として掲載されていました。

III. STC1の生理機能

i) 抗アポトーシス作用

筆者の共同研究者である大河内眞也博士（現　東北大学）は、米国Tulane大学留学中、以前に報告されていた骨髄由来間葉系幹細胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells; BMMSCs）が障害を受けた肺の修復に寄与するという現象に着目し [6]、同僚のGregory Block博士（後に筆者とも同僚）とともに、そのメカニズムの解明を試みていました。その過程で、紫外線照射により障害を受けたヒト由来線維芽細胞とヒト由来BMMSCs（hBMMSCs）を共培養すると、線維芽細胞の障害が軽減することを見出しました（図４）。詳細な研究の末、hBMMSCsにより分泌されるSTC1が障害細胞のアポトーシス抑制作用に関わっていることを明らかにしました [7]。まさか魚類のミネラル調節ホルモンが哺乳類の細胞でこんな役割を持っていたとは！二人の興奮が最高潮に達したことは想像に難くありません。この二人の発見が、筆者らの現在まで続くSTC1研究の端緒となりました。

日本実験動物医学会は、下記の2名を日本獣医学会学術集会優秀発表賞　受賞候補者として推薦し、日本獣医学会理事会で承認されましたので、ご報告します。

受賞者の先生方おめでとうございます。

受賞者　　朝比奈良太（京都大学大学院医学研究科皮膚科学）

受賞課題　病原性CD4+組織常在性記憶T細胞の駐在制御に基づくアレルギー性皮膚疾患に対する新規治療戦略

受賞者　　田村　友和（北海道大学大学院医学研究院微生物学免疫学分野病原微生物学教室 / ボストン大学 / プリンストン大学）

受賞課題　ヒト胎児肺を移植したヒト免疫マウスの作製とCOVID-19の病態解析への応用

 2. トーランス型扁平異形成症モデル : M413/M856マウス

　次に紹介するM413とM856マウスは共に常染色体顕性形式で体が小型化 (矮小化) するマウスです⁷⁾⁸⁾。連鎖解析によって原因遺伝子は共に第15染色体上にマップされたことから、両マウスの原因遺伝子は同一の可能性があると思われました。この領域に存在する遺伝子を調べた結果、軟骨で特異的に産生される II型コラーゲンをコードするCol2a1が原因遺伝子の第一候補として選抜され、確かにM413マウスのCol2a1遺伝子にはp.Try1391Ser、M856マウスにはp.Asp1499Alaミスセンス変異が同定されました。

　ヒトにおけるCOL2A1変異は、軟骨無発生症II型、トーランス型扁平異形成症(PLSD-T)、先天性脊椎骨端異形成症といった別々の病気の原因となりますが⁹⁾ 、PLSD-T患者にp. Try1391Cys、p. Asp1469His変異が同定されていました。すなわち、II型コラーゲンの1391番目のCys、1469番目のAspが、M413またはM856マウスとPLSD-T患者で共に置換されている訳です。それぞれの変異のホモ接合マウスはPLSD-Tと類似の骨格異常を示しており、M413/M856ホモ接合マウスはPLSD-Tモデル動物として有用性であることが示されました。M413とM856マウスの間に表現型の違いはみつかっていませんが、別々の論文として発表することができました⁷⁾⁸⁾ 。

　両マウスの軟骨細胞を電子顕微鏡で観察すると、小胞体が異常に拡張しており、変異コラーゲンタンパク質が小胞体内に貯留していました(図2A)。軟骨における小胞体ストレスマーカーの発現が上昇しており、軟骨細胞は高頻度にアポトーシスを起こしていました(図2B)。つまり、M413/M856ホモ接合マウスの軟骨細胞では異常タンパク質の貯留により過度の小胞体ストレスが付加され、アポトーシスが亢進していることがわかりました。PLSD-Tの第一の原因はII型コラーゲンが細胞外へ分泌されないことですが、軟骨細胞におけるアポトーシスの亢進も大きく関わっているようです。

　最近、さまざまな疾患と小胞体ストレスとの関連が注文されており、小胞体ストレス応答調節薬の創薬研究が展開されています¹⁰⁾。M413/M856マウスは小胞体ストレス応答調節薬の創薬研究に有用なモデル動物ですと締めたいとこですが、応用は難しいと思っています。PLSD-Tは周産期致死性の重度の骨格異常を示し、PLSD-TモデルとなるM413/M856ホモ接合マウスは出生後、すぐに死亡してしまいます。このような致死性の骨格異常を薬で直すのは、現時点では不可能であると思います。しかし、小胞体ストレスが関わっている軽度の骨格異常を示す疾患は存在しており、これらの疾患を対象とした小胞体ストレス応答調節薬の創薬研究に、M413/M856マウスから調整した培養軟骨細胞などが貢献できるかもしれません。

○循環管理：麻酔下においては、外科処置中の出血や不感蒸泄などによる循環血液量の減少、不適切な麻酔深度による血圧、心拍出量の低下、モデル動物の病態に起因した循環不全や不整脈に対応するため、心電図、心拍数、血圧をモニターする必要があります。

　術中は循環血液量を維持（心拍出量、血圧の維持）するために基本的に輸液（10～15ml/kg/hr）を行います[1, 2]。ブタでは経験的に、輸液量が少ないと腹腔内臓器を展開する際に血行動態の変化が著しく、循環管理が難しくなることがあるため、輸液はしっかりと実施した方が良いと考えています。私は絶食処置を行ったブタでは脱水（循環血液量の減少）傾向があるように感じています。絶食にともなって飲水量が減少するのかもしれません。そのため、臓器移植など侵襲の大きい外科手術を行う際には、輸液開始1時間ほどは流量を多め（30～40ml/kg/hr）にすることをお勧めします。

　また、侵襲の大きい手術の際には必ず尿量をモニタリングする必要がありますが、雄ブタではそのペニスの形状から外尿道口からカテーテルを挿入することが困難なケースがほとんどです。この場合、我々は必要に応じて開腹し、膀胱にカテーテルを留置します。

○体温管理：術中は麻酔や開腹/開胸により体温が低下しやすい状況にあります。体温が著しく低下すると血圧低下や徐脈、不整脈などの循環不全や代謝性アシドーシスの進行が認められ、生命を脅かすことがある[1]ため、ブランケットや保温マット（図4）の利用により体温の保持に努めます。また、ブタでは揮発性吸入麻酔薬や筋弛緩薬などを用いた際に、悪性高熱（筋硬直、頻脈、異常な高熱）が認められることがあるので注意が必要です。

術後管理：術後の低体温を防止するための保温の実施や手術領域によってはサードスペースへの細胞外液喪失による循環血液量の減少を補うため輸液の実施について、検討、準備しておく必要があります。また、感染防止の抗生剤の投与や鎮痛剤の投与についても実施します。なお、抗生剤、鎮痛剤の投与は術前から実施しておくことが推奨されます。

　以上、ブタの麻酔について、総論的な内容を経験も交え、ざっくりと紹介しました。先生方の参考になれば幸いです。

参考文献

1. Lais M. Malavasi. (2015). In “Veterinary Anesthesia and Analgesia, The fifth edition of Lumb and Jones” (Kurt A.Grimm ed). pp928-939, Wiley Blackwell, UK.Paul Flecknell. (2015).

2. Laboratory Animal Anaesthesia 4th edition. pp 77-108, 238-242, Academic press, UK.

3. Alison C. Smith and M. Michael Swindle. (2008). Anesthesia and Analgesia in Swine. In “Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals 2nd edition” (Richard E. Fish, ed). pp 414-436, Academic press, UK.