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文献紹介の記事一覧

運動器を制御する非線維性コラーゲン分子の役割  〜遺伝子改変マウスモデル研究からわかったこと〜

岡山理科大学獣医学部 伊豆弥生(JALAM教育委員会)

 コラーゲンは、哺乳動物を構成するタンパク質の中で最も多く含まれる(全タンパク質の約30%)細胞外マトリクス構成成分であり、3本のa鎖からなる3重らせん構造(コラーゲン構造)を特徴とした分子群を表します。コラーゲン分子は、現在までに28種類が発見され、順番にI型、II型とローマ数字で番号が付けられています。コラーゲン分子は、自身が重合し線維を形成する線維性コラーゲンと、線維形成をしない非線維性コラーゲンの2つに大別されます。「コラーゲン」としてよく知られているのは、I型やII型であり、これらは線維性タイプに分類され、組織の構造基盤を構築します。一方、非線維性タイプは、ビーズ状や膜貫通型など様々な構造をもち、線維性タイプが作る線維の太さや長さなどの調節に関与する他、細胞の増殖や分化など、生理活性分子として機能することも知られています。私はこれまで、非線維性コラーゲンのうち、VIとXII型コラーゲンに着目して研究を行ってきましたので、本コラムでは、これらコラーゲン分子による運動器制御機構について、動物モデルの研究結果とともに紹介したいと思います。

1. 結合組織と筋肉を制御するVI型コラーゲン

 VI型コラーゲンは、a1、a2、a3鎖のヘテロトリマーを形成し、細胞外ではビーズ状あるいはマイクロフィブリル構造として認められる分子です。VI型コラーゲンは、N末端とC末端に球状のドメインを持ち、この部分でI、II、IV、XIV型コラーゲンやインテグリン、NG2プロテオグリカンなど様々な細胞外マトリクス分子と相互作用することで、細胞や組織の安定性に寄与していると考えられています(1)。ヒトのVI型コラーゲン遺伝子(COL6A1COL6A2COL6A3)変異は、重症型のウルリッヒ病(厚生労働省指定難病29)と軽症型のベスレムミオパチー(同指定難病31)の原因として知られ、日本ではそれぞれ約300人、100人の罹患者がいると報告されています。本疾患は、生後初期から遠位関節の過伸展、近位関節の拘縮、ならびに筋肉量と筋力の低下を主徴としています。すなわち、筋肉だけでなく、結合組織も機能障害を受けることを特徴とする疾患です。

 Bonaldoらは、1998年にヒトCOL6A1遺伝子のマウスオルソログであるCol6a1遺伝子を欠損させたマウスを作出し、VI型コラーゲンが欠失すること、ベスレムミオパチーの病態モデルとなることを発表しました(2)。彼らはまた、VI型コラーゲン欠失は、持続的なアポトーシスや酸化ストレスの増加、オートファジーの減少を引き起こすことを明らかにし、これが筋再生を障害していると結論づけています(3)。この結果をサポートするように、Merliniらは、VI型コラーゲンの下流のシグナル分子をターゲットとした処置により、病態モデルマウスと罹患者で治療効果を報告しており(4)、VI型コラーゲンが調節する細胞内制御機構が筋病態の発症に重要であることが明らかになってきました。

 一方、我々のグループは、Col6a1遺伝子欠損マウスの腱と骨の研究から、VI型コラーゲンの細胞外マトリクスとしての重要性を明らかにしました。腱は、I型コラーゲン細線維を最小単位とし、これが線維、線維束と集合した構造体であり、各ユニットは、それぞれエピテノン、エンドテノン、ペリテノンと呼ばれる結合組織の膜で覆われ、伸縮時に独立して動くことで、腱の柔軟性を維持しています。一方、I型コラーゲンを産生する腱細胞は、発生・成長過程において、腱の長軸方向に沿って縦列し、細胞体同士で結合することで、縦に連なる細胞群として認められ、同時に、横方向へと細胞突起を伸ばし、近隣の細胞と結合します。腱細胞で産生・重合されたI型コラーゲン細線維は、腱の長軸方向に沿って分泌され、横方向に伸張した腱細胞突起で取り囲まれることで、線維ユニットが形成されます。VI型コラーゲンは、上述した腱の結合組織膜に局在しており、Col6a1遺伝子欠損マウスでは、腱細胞は変形し、突起形成が抑制されることが電子顕微鏡学的解析により明らかになりました。また、細胞外では、I型コラーゲン細線維の配向性の乱れや細線維の密度が増加するとともに、腱の力学特性が低下しました。このため、細胞外のVI型コラーゲンは腱細胞の形状を維持することで、I型コラーゲンの分泌や配向性の制御、その結果として生じる力学的特性の獲得に寄与すると考えられました(5)。実際、このような細胞の変形は、COL6遺伝子変異患者から得られた腱細胞や(6)、Col6a1欠損マウスの骨芽細胞でも確認されています(7)。以上のように、我々は、細胞外VI型コラーゲンが細胞と細胞外環境の維持において重要な役割を担うことを明らかにしました。これらの知見から、細胞外のVI型コラーゲンが欠失することで、細胞形状を維持することが難しくなり、アポトーシスなど細胞内制御が破綻し、筋肉や腱の機能障害を引き起こすと推測されます。

2. 結合組織と筋肉を制御する新たな分子―XII型コラーゲン

 我々とHicksらのグループは、2014年に、VI型コラーゲン遺伝子疾患と類似した臨床症状を持つヒトの患者からXII型コラーゲン遺伝子(COL12A1変異を同定しました(8)(9)。現在では、本疾患はエーラス・ダンロス症候群(厚生労働省指定難病168)のミオパチー型(mEDS)として分類されています(10)。mEDSは、遺伝子が同定されたことで、2014年以降、世界中で患者数が増加している疾患です。XII型コラーゲンは、3重らせん構造からなるコラーゲン領域が非コラーゲン領域により分断された構造を特徴するFACIT(Fibril Associated Collagens with Interrupted Triple Helices)に分類されるコラーゲン分子で、VI型コラーゲンとは全く異なる構造をとります。XII型コラーゲンは、2つのコラーゲン領域と3つの非コラーゲン領域で構成され、大きいNC3領域を持つことから、この部位で様々な分子と相互作用すると考えられています。我々は、2011年にマウスのXII型コラーゲン遺伝子(Col12a1)欠損マウスを作出し、ヒトmEDSの病態モデル動物となることを報告しました。現在までに、Col12a1欠損マウスは、体が小さく、筋肉、腱、骨が脆弱化することがわかっています(11)(8)(12)。我々は、XII型コラーゲンの機能を解明するため、Col12a1欠損マウスから単離した初代培養の腱細胞と骨芽細胞を用いた免疫細胞染色により、XII型コラーゲンの局在を解析しました。その結果、XII型コラーゲンは細胞が隣接する細胞と結合する際、細胞間を物理的に結合するコラーゲンブリッジを形成することを見出しました(図1(13)(12))。また、ギャップ結合を通過する色素を用いた細胞間コミュニケーション機能解析では、XII型コラーゲンが欠損すると、骨芽細胞間での色素交流が認められないことから、XII型コラーゲンが細胞間コミュニケーションに必要不可欠な分子であると考えられました。これらの知見から、mEDS病態でみられる結合組織の脆弱化は、細胞間コミュニケーション障害に起因すると我々は考えています。

3. VI・XII型コラーゲンの相互作用

 上述したように、VI型コラーゲン遺伝子疾患とmEDSは類似した病態をとることから、原因となるVI型とXII型コラーゲンの共通した機能の存在が推測されます。我々は、XII型コラーゲン解析で見られたコラーゲンブリッジ形成について、VI型コラーゲンの関与を解析したところ、興味深いことに、VI型コラーゲンもまた細胞間を物理的に結合するコラーゲンブリッジを形成することを見出しました。また、Col12a1欠損マウス由来細胞では、VI型コラーゲンによるコラーゲンブリッジ形成は抑制され、Col6a1欠損マウス由来細胞でも同様な結果を得ることができ、これら分子がともに細胞間の物理的結合を担うことを明らかにしました(13)。加えて、Wehnerらは、ゼブラフィッシュの脊髄損傷モデルを用いた実験から、組織再生時に伸長する神経細胞は隣接する細胞とXII型コラーゲンを介して結合することを報告しており(14)、コラーゲンブリッジが組織形成だけでなく、組織再生においても重要な役割を担うと考えることができます。以上の知見から、VIおよびXII型コラーゲンによる細胞間の物理的結合が、細胞形状維持と細胞間コミュニケーションの構築に必須であり、これにより組織・臓器の機能性維持に寄与するものと我々は考えています(図1)。

4. 今後の課題

 今回紹介したVI及びXII型コラーゲンは、結合組織と筋肉の両方の働きと密接に関わる分子であることが分かってきましたが、結合組織での機能が明らかになる一方、筋肉での機能解明には至っていません。筋疾患を始め未だ解明されていない病態には複雑な背景が存在しているでしょう。これら背景には、各臓器でのローカル制御だけでなく、臓器間クロストーク制御など全身性の制御機構が関与していると考えられており、組織あるいは細胞特異的、時期特異的など、さまざまな条件で遺伝子発現を制御する実験動物モデルを作出することで、複雑な病態の解明につながると期待されます。

参考文献

1.       Cescon M, Gattazzo F, Chen P, Bonaldo P. Collagen VI at a glance. J Cell Sci. 2015;128:3525–31. 

2.       Bonaldo P, Braghetta P, Zanetti M, Piccolo S, Volpin D, Bressan GM. Collagen VI deficiency induces early onset myopathy in the mouse: An animal model for Bethlem myopathy. Hum Mol Genet. 1998;7(13):2135–40. 

3.       Castagnaro S, Gambarotto L, Cescon M, Bonaldo P. Autophagy in the mesh of collagen VI. Matrix Biol. 2021;100–101:162–72. 

4.       Merlini L, Bernardi P. Review article. Neurotherapeutics. 2008;5(4):613–8. 

5.       Izu Y, Ansorge HL, Zhang G, Soslowsky LJ, Bonaldo P, Chu M-L, et al. Dysfunctional tendon collagen fibrillogenesis in collagen VI null mice. Matrix Biol. 2011;30(1):53–61. 

6.       Antoniel M, Traina F, Merlini L, Andrenacci D, Tigani D, Santi S, et al. Tendon Extracellular Matrix Remodeling and Collagen VI Mutations. Cells. 2020;9(2):409. 

7.       Izu Y, Ezura Y, Mizoguchi F, Kawamata A, Nakamoto T, Nakashima K, et al. Type VI collagen deficiency induces osteopenia with distortion of osteoblastic cell morphology. Tissue Cell. 2012;44(1):1–6. 

8.       Zou Y, Zwolanek D, Izu Y, Gandhy S, Schreiber G, Brockmann K, et al. Recessive and dominant mutations in COL12A1 cause a novel EDS/myopathy overlap syndrome in humans and mice. Hum Mol Genet. 2014;23(9):2339–52. 

9.       Hicks D, Farsani GT, Laval S, Collins J, Sarkozy A, Martoni E, et al. Mutations in the collagen XII gene define a new form of extracellular matrix-related myopathy. Hum Mol Genet. 2014;23(9):2353-2363. 

10.     Malfait F, Francomano C, Byers P, Belmont J, Berglund B, Black J, et al. The 2017 International Classification of the Ehlers–Danlos Syndromes. Am J Med Genet Part C. 2017;26:8–26. 

11.     Izu Y, Sun M, Zwolanek D, Veit G, Williams V, Cha B, et al. Type XII collagen regulates osteoblast polarity and communication during bone formation. J Cell Biol. 2011;193(6):1115–30. 

12.     Izu Y, Adams SM, Connizzo BK, Beason DP, Soslowsky LJ, Koch M, et al. Collagen XII mediated cellular and extracellular mechanisms regulate establishment of tendon structure and function. Matrix Biol. 2021;95:52–67. 

13.     Izu Y, Ezura Y, Koch M, Birk DE, Noda M. Collagens VI and XII form complexes mediating osteoblast interactions during osteogenesis. Cell Tissue Res. 2016;364(3):677–9. 

14.     Wehner D, Tsarouchas TM, Michael A, Haase C, Weidinger G, Reimer MM, et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nat Commun. 2017;8(1):126. 

コラム

がんも遺伝する:モード・スライの功績

 現在では、化学物質、活性酸素、ウイルス感染、生活習慣や加齢など、さまざまな原因により複数の遺伝子に異常が生じ、がんが生ずることがわかってきている。本コラムでは、実験動物学の黎明期である1900年代初頭の化学発がん説やウイルス発がん説が優勢な頃、マウスを用い、がん遺伝説を提唱したモード・スライ(Maud Slye)を紹介します。

独楽鼠(こまねずみ)

 リンネが名付けたマウスの学名「Mus musculus(ラテン語)」のmusは古代サンスクリット語の「泥棒」を意味するmushaに由来している。ディズニーが自室に迷い込んだマウスを餌付けし、このマウスを参考にキャラクターを考案したというのは架空の話のようだが、招かれざる客が、歓迎すべき客となり、飼い慣らし繁殖したものが現在の愛玩用マウス(ファンシーマウス)になったとの説が有力である。他の愛玩動物と同様、古代より愛好家たちは、興味深い毛色や行動パターンを持つ珍しいタイプを選んで交配・維持してきたようだ。1920年代には、英米でマウス愛好家組織が結成されたほどポピュラーな存在になった。このムーブメントは1927年のミッキーマウスの誕生にも影響を与えたかもしれない。

 1890年代の米国では、ワルツを踊るようにくるくる回る、ジャパニーズワルチングマウス(Japanese waltzing mouse :JWM)がペットとして人気を博した。心理学者のロバート・ヤーキーズは、このマウスの由来や習性を調べ本にまとめている [1]。このワルツを踊るマウスは、紀元前の中国の漢の時代の文献に登場している。日本では独楽鼠または舞鼠と言われていた。JWMは、中国から日本を経て欧州に到着し、その後、米国に上陸したと思われる。ヤーキーズが所有したJWMは、白地に黒の斑点や縞模様が入っていたことから、JF1マウス(パンダマウス)と同様、エンドセリン受容体B型遺伝子(Ednrb)の変異をもっていたのであろう [2]。JWMは、旋回運動を示すほか難聴でもあり、これらの症状は、遺伝性の内耳の構造異常に起因する場合が多い。平衡感覚がおかしいので、体勢を維持するために旋回するのである。この表現型(遺伝変異)を持つマウスは1947年にジョージ・スネルによってジャクソン研究所へ導入され、現在でも同所に受精卵が凍結保存されている[2]。2001年に、聴覚と平衡感覚器官の異常の原因としてカドヘリン23遺伝子の変異が同定された [3, 4]。また、カドヘリン23は、人の先天的難聴を伴う遺伝病であるUsher症候群の原因遺伝子と同一であることが判明した [5]。

近交系黎明期

 以前のコラムでクラレンス・リトルと共に登場したアビー・ラスロップは、1900年、マサチューセッツ州グランビーでペット用の小動物の繁殖会社を起業する。彼女が所有したJWMのペアなど様々な種類の小動物は、ペットとして飼われる他に、全米の多くの研究者から注文が相次いだ。1900年に、メンデルの法則の再発見に関連する論文が発表され、多くの研究者が、同法則の動物への適用に関心を持ったのも一因である。ラスロップが収集・生産したマウスは、すでに毛色などを指標に近親交配を繰り返しており血縁係数が高いものであったようだ。1908年には早くも、ラスロップは、生活環境はほぼ同じであるにもかかわらず、JWMを含むマウスの家系によって、腫瘍の発生部位や発生率が異なることに気づく。1918年までに(この年、彼女は他界)、病理学者のローブと共に、数世代に渡る遺伝実験を行い、マウスの癌の遺伝に複数の因子が関与している可能性を示した [6]。アーネスト・ティザー(ティザー病で有名)も、1907年、マウス家系によって自然発生する腫瘍の発生率が異なることを報告している [7]。

 前コラムの繰り返しになるが、リトルとティザーは、JWMに生じた肉腫の雑種への移植は成功するが、逆方向の移植は拒絶されるという発見をした [8]。この観察からリトルは、がんの研究を進めるためには、遺伝的に非常に近い近交系(純系)動物を作らねばならないと考え、1919年にDBAという純系のマウスを作出した。この発見は、1936年の主要組織適合性複合体およびH-2抗原の発見へと発展していくが、近交系動物が医学・生物学の進歩に及ぼした貢献は計り知れない。

 新しい概念の発見が、同時に複数の研究者によってなされることがある。最近では、免疫チェックポイント阻害薬の抗PD-1/ PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体であろうか(本庶佑とジェームズ・アリソンが2018年ノーベル生理学医学賞)。ラスロップ、リトル、ティザー達と同時代に、ひっそりと純系マウスを育て研究している人がいた。

モード・スライ [9, 10, 11, 12]

 スライは、1869年、ミネソタ州ミネアポリスで生まれた。シカゴ大に入学後、裕福ではなかったこと、また、当時、女性向けの奨学金はほとんどなかったことから、学費と食費を稼ぐためのアルバイトと勉学の多忙な大学生活を送る。その結果、体調を崩し、シカゴ大学を中退する。1899年、編入したブラウン大学で学士号を取得した。その後、師範学校の心理学の教職につき、遺伝学や精神医学に触れることになる。1908年、教師の仕事を辞め、シカゴ大学の動物学教授のもとで助手を務めることになった。病気の遺伝に興味を持っていた彼女は、6匹のJWMを使って研究を始め、JWMが、がん好発系でもあったことから、旋回運動の遺伝様式ではなく、がんの遺伝様式を調べることにした。がんを発症するマウスと、がんにならないマウスを交配させ、その子孫がどうなるかを観察した。彼女は、シカゴ大学構内の家に、数多くのマウスと暮すことになる。1911年にシカゴ大学の正規職員になるまでは、自費でマウスや餌、床敷を購入し、1日18時間、一人で多くのマウスの世話と観察を行った。マウスのために食事をしないことも度々あった。晩年の講演で述べているが、ケージを滅菌するなど衛生状態に非常に気を使っていたため、常時、数千匹のマウスを収容する実験室では、30年間、感染症の発生は無かった。飼育の状態や食事などの環境因子を極力同一にし、表現型のばらつきが生じないようにした。すべてのマウスの背後には、彼女が書き続けた100世代以上の先祖からの遺伝記録、臨床記録、剖検記録、組織学的記録が存在する。そのため、すべてのマウスの背景情報がわかり、どんな病気にかかりやすいか、何歳まで生きるか、どのような原因で死ぬかも予想できたようだ。彼女は、30年以上の研究生活で15万匹のマウスを交配・飼育して、マウスの表現型を詳細に観察し、そのうち3万匹に様々ながんが発生したことを記録している。1914年までに、5000匹にも及ぶ質量共に膨大な遺伝実験と剖検によって遺伝性腫瘍の存在を確認し、さらにがん抵抗性は優性形質、がん感受性は劣性形質であるとの説や、がん発生には特定の部位に継続的な刺激が必要であると提唱した。この結果をアメリカ癌学会や論文で発表し、脚光を浴びることになる。彼女の説は、上述のリトルから、がんにおける遺伝が果たす役割を単純化しすぎており、実際に起こっていることは、単一遺伝子のメンデル遺伝で説明されることよりも複雑であるという批判を受けた。しかし、筆者は、彼女の説は、今では当たり前となった遺伝性がんの概念を初めて発見したという点で極めて重要だったと思う。その後、彼女は研究を進めるうちに、がんの発生は遺伝の関与だけでは説明できないことを認識するようになる。後年、彼女は、がんの発生には、「遺伝的な感受性」と「がんになりやすい組織への長期的な刺激」という2つの条件が必要であると考えた。現在、遺伝性がんは、がん全体の10%程度であり、環境要因がどのように遺伝子を変化させ最終的にがんを引き起こすか、という研究が盛んに行われている。スライの研究はその端緒となった。1922年には助教授に、1926年に准教授に昇進した。1936年、欧州で開催された国際がん対策会議に出席のために、彼女はマウスを助手に任せ、26年ぶりに休暇を取った。それ以前には、カリフォルニアで病気療養中の母親を訪ねる際には、トレーラーを借りてマウス達を連れて行った。彼女は、1914年に米国医学協会から、1922年に米国放射線学会から金メダルを授与された。1923年にノーベル賞の候補にもなったが、受賞には至らなかった。また、1915年にシカゴ大学からリケッツ賞を、1937年にブラウン大学から名誉博士号を授与された。1944年にシカゴ大学を定年退職した後、余生をデータ解析に費やし、1954年に心臓発作で亡くなった。

 彼女の楽しみは詩を書くことだった。1934年と1936年の2冊の詩集を出版し、約700編の詩を発表した。一部の詩は彼女の科学への献身的な取り組みを物語っている。

I pace the world because I am storm-driven, By this compelling of creation.

「私が世界を歩むのは、この創造の説得力によって駆り立てられているからである」

The robin does not wait to ask you like his song, He sings because he must.

「コマドリは自分の歌が好きかどうかを聞くために待つのではなく、必要だから歌うのだ」

 スライの時代には、解析手法がなかったこともあり、がんの遺伝様式の観察に留まり、がんの原因や発症メカニズムを見出すことはできなかった。がんの発生機序は、がん遺伝子SRC(1976年)やRASの発見(1982年)、がん抑制遺伝子RBの発見(1986年)をきっかけに解明されていくのは周知の通りである。また、多数の遺伝子が作用し、さらに環境要因が加わって起こる病気のことを多因子疾患というが、がんの多くは、正に多因子疾患である。多因子疾患の原因遺伝子の同定が可能になるには、2000年代まで待たなければならなかった。

 本コラムでは、あまり語られることはありませんが、重要な発見し、且つ心に残る研究者を取り上げました。彼女の根気よく真実に迫る執念や持続性を、是非、見習いたいものです。また、古のマウス研究者達の努力と功績に感謝しつつ、この分野の発展に微力ながら貢献したいと思いながら、筆を置かせて頂きます。

参考文献

[1] Robert Yerkes, The Dancing Mouse: A Study in Animal Behavior. 1907.

[2] https://www.jax.org/strain/000275

[3] Wilson SM et al, Mutations in Cdh23 cause nonsyndromic hearing loss in waltzer mice. Genomics. 74(2):228-233. 2001.

[4] Di Palma F et al, Mutations in Cdh23, encoding a new type of cadherin, cause stereocilia disorganization in waltzer, the mouse model for Usher syndrome type 1D. Nat Genet. 27(1):103-107. 2001.

[5] Bolz H et al, Mutation of CDH23, encoding a new member of the cadherin gene family, causes Usher syndrome type 1D. Nat Genet. 27(1):108-112. 2001.

[6] Abbie Lathrop & Leo Loeb, Further investigations on the origin of tumors in mice. V: The tumor rate in hybrid strains. Journal of Experimental Medicine. 28(4): 475-500. 1918.

[7] Ernest Tyzzer. A study of heredity in relation to the development of tumors in mice. The Journal of Medical Research. 17(2):199-211. 1907.

[8] Clarence Little & Ernest Tyzzer. Further experimental studies on the inheritance of susceptibility to a transplantable tumor, carcinoma (J.W.A.) of the Japanese waltzing mouse.  The Journal of Medical Research. 33(3): 393-453. 1916.

[9] Maud Slye, The incidence and inheritability of spontaneous cancer in mice.  The Journal of Medical Research 32: 159–172. 1915.

[10] https://mag.uchicago.edu/science-medicine/storm-driven

[11] https://www.lib.uchicago.edu/ead/rlg/ICU.SPCL.SLYEM.pdf  Guide to the Maud Slye Papers 1910s-1930s, University of Chicago Library.

[12] Maud Slye, Proceedings. The genetics of cancer in mice. Forty-first annual meeting of the United States livestock sanitary association. 241-257. 1937

コラム

米国獣医学会(AVMA)動物の安楽死指針2020年版出版記念 -紹介動画-

 日本実験動物医学専門医協会は、AVMAと翻訳契約を取り交わし、「米国獣医学会 動物の安楽死指針(安楽死ガイドライン):2020年」版の翻訳本(翻訳者代表 黒澤努、鈴木真)を出版しました。本ガイドラインは、国際的に容認される具体的な安楽死法を示しており、主に獣医師を対象に記載されています。専門的ではありますが、最新の情報を網羅しており、獣医師以外の動物にかかわる方々の指針としても重要な文献です。(原文はこちら

 2013年度版から改訂された2020年版では、第3章にS1コンパニオンアニマル、S2実験動物、S3家畜、S4馬、S5鳥類、S6魚類と水生無脊椎動物、S7野生動物と7つの動物に区分されて記載されています。

 日本実験動物医学会および日本実験動物医学専門医協会は、本指針が広く周知されることで、わが国の動物福祉がより向上することを期待します。また、実験動物ならびにその他の動物の人道的な取り扱いを広めるための啓蒙活動を継続していきます。

米国獣医学会(AVMA)動物の安楽死指針(安楽死ガイドライン)2020年版の紹介

https://vimeo.com/719001280

炭酸ガスを用いた安楽死

https://vimeo.com/710990217

Compassion Fatigue(共感疲労)

https://vimeo.com/710990398
https://vimeo.com/720976209

Compassion Fatigueについて、さらに知りたい方はこちらもご覧ください。

安楽死にまつわる諸問題 part2

動物実験従事者におけるCompassion Fatigueの分類(ProQOLを用いた分類)

特集

文献紹介:フィンランドにおける実験用ビーグルの最初のリホーミング:社会化訓練からフォローアップまでの完全なプロセス

The First Rehoming of Laboratory Beagles in Finland: The Complete Process from Socialisation Training to Follow-up

Laura Hänninen, Marianna Norring

Altern Lab Anim. 2020 May; 48(3): 116-126. doi: 10.1177/0261192920942135

概要
実験動物の運命は、倫理的なジレンマであり、社会的な関心事でもある。EUでは、指令2010/63/EUにより、安楽死ではなく、元実験動物のリホーミングが認められている。しかし、我々の知る限り、フィンランドでビーグルのリホーミングが行われたという報告は過去にない。本研究は、ヘルシンキ大学で初めて行われた実験用ビーグルのリホーミングの過程を説明し、その成功を評価することを目的としている。動物保護団体とヘルシンキ大学の協力のもと、合計16頭の元実験用ビーグルが里親として迎えられた。これらの犬は、動物の認知に関する研究に参加したり、動物用医薬品の開発中に小さな処置を受けたりした経験があります。犬たちがまだ実験室にいた頃、数ヶ月に及ぶ社会化トレーニングプログラムが実施された。里親へのアンケート調査、関係者(研究者、動物保護団体、動物管理者)へのインタビューを通じて、社会化トレーニングプログラム、若い犬と高齢の犬の再導入の比較成功、里親の選定基準、新しい飼い主への再導入の成功など、全体のプロセスが評価された。大半の犬は新しい家庭環境によく適応した。実験的な使用を終えた時点で安楽死させることは不必要であり、欧州指令の目的に反する可能性があった。

フィンランドでは、科学的または教育的目的のための動物の使用を対象とする国内法(Act 497/2013)があり、科学的目的のために使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63/EUに基づいています。
EU指令は実験動物の運命に関わり、すべての欧州機関に実験犬が実験用途に不要になった後にリホーミングする機会を与えています。
Article 19では、実験に使用された動物は、動物の健康状態がそれを許し、公衆衛生、動物の健康、環境に対する危険がない場合、一定の条件を満たせば、リホーミングすることができるとしています。また、EU指令の前文26には、「手続きの最後に、動物の将来に関して、動物福祉と環境への潜在的なリスクに基づいて、最も適切な決定がなされるべきである。福祉が損なわれるような動物は、殺処分されるべきである」との記述もあります。
したがって著者らは、暗黙の了解として福祉が損なわれない動物は殺処分されるべきではないと考えています。
本研究は、フィンランドで行われた実験用ビーグルの最初のリホーミングと社会化プログラムについて述べたものです。

対象となった実験用ビーグル犬はヘルシンキ大学が所有する16頭で、すべての犬は商業ブリーダー(オランダのハーラン社)から購入したもので、高齢グループは生後6カ月から8歳まで、若年グループは生後4カ月から2歳まで研究施設で飼養されました。どちらも避妊・去勢済みの8頭(雌2頭、雄6頭)でした。
これらの犬は、犬での実験が必要な動物用医薬品の開発研究として、非侵襲的動物認知研究と犬用の新しい鎮静剤に関する臨床獣医学研究に使用されていました。実験処置としては、前者の研究では、ポジティブオペラント条件付け法によって、コンピュータ画面上の視覚刺激をじっと観察し、脳波や眼球運動を非侵襲的に記録するように訓練されました。後者の研究では、数回の鎮静処置が行なわれ、血液の採取、呼吸と心臓の機能のモニターが実施されました。

社会化トレーニングは、犬を研究施設の外に連れ出しさまざまな路面やリードでの歩行に慣れさせること、屋外での排便・排尿を促すこと、犬不慣れな人を施設に迎え入れることから構成されていました。
高齢犬は1回あたり約1時間、半年間で25〜35回散歩させました。若齢犬には、4ヶ月の準備期間を設け、研究施設に隣接するフェンス付きのパドックで監視下での遊びや休憩も含めて個別にトレーニングが実施されました。また、犬の反応や初対面の人に対する心構えも評価しています。
このトレーニングには、アニマルケアテイカー、研究者、動物保護団体のスタッフ、犬の訓練士など、多くの人が関わりました。また、動物保護団体とその地域会員組織がヘルシンキ大学とともに新しい里親探しを行い、それぞれの犬の所有権を大学から動物保護団体に、そして動物保護団体から新しい所有者に譲渡する契約が結ばれました。残念ながら、最後の1頭となった老犬には不安な行動が見られたことから、慣れ親しんだ8頭の群れがないまま施設にとどまることになりました。

アンケートはリホーミング後1ヶ月、半年〜1年、4年の3回実施され、回答したすべての飼い主が圧倒的に新しい犬を溺愛し、その性格の良さを賞賛していました。人間から攻撃されたとの報告はありませんでした。しかし中には、初めての人や状況、音、知らない犬、飼い主との別れ、車での移動などに対して恐怖心を示す犬もおり、リホーミングから4年後の最終アンケートでは、ほぼすべての犬が分離不安を抱えていることが明らかになりました。

全体的な結果としては、行動上の問題はほとんど報告されず、親しい人や家族の他の犬に対して攻撃的であったり、遊びの最中に噛みついたりする犬もいませんでした。また、爪切りなど、犬の扱いに困難はなかったと報告されています。ただし、最終的なアンケートでは、ほとんどの飼い主がトイレのしつけが不十分であると答えていました。

動物保護団体への聞き取り調査によると、これらの犬は小型で穏やかで扱いやすいため比較的容易にリホーミングできると考えていたようです。ところが、その後は無事に再飼育されましたが、若齢犬のうち3頭(2件の里親から)は動物保護団体に戻されました。また、4年間の期間中には老齢犬4頭、若齢犬1頭が安楽死されました。4頭は健康上の理由、1頭は行動上の問題が続いたことが理由でした。

   

リホーミング後のビーグルの生活において、トイレのしつけに問題があるようでしたが、リホーミングの結果は他の文献紹介にもあるように良好な結果でした。
リホーミングに向けて半年から10カ月のトレーニングが実施され、万全な準備がなされたのではないかと推察できますし、元々非侵襲的な動物認知研究に用いられておりトレーニングに慣れているビーグルであったようにも推察されました。しかし、残念ながら1頭がリホーミングを断念されたこと、3頭が一度里親から返却されたことからは、リホーミングの難しさも垣間見えるのではないかと思います。
分離不安には里親での飼育方法も関連しているとは思いますが、新たな環境においてもストレスを溜め込んでしまう状況もあるのかもしれません。さらに、文化の違いもあるとは思われますし、理由もありますが、リホーミングから4年の間に5頭のビーグルに安楽死が選択されたことも憂慮される点かもしれません。
著者らはさらに家畜など他の多くの動物種のリホーミングの機会もあったことを述べていますが、回答としては、リホーミングのアイデアは気に入っているものの、他の動物にとっては今回のケースで使用された社会化プログラムは、あまりにも計画が不十分で、性急かつ無秩序であったとの見解が示されたと述べています。

リホーミングは実験動物の余生を考える素晴らしい方法ではありますし、著者らもリホーミングを推奨してはいますが、この文献では課題として憂慮されるプロセスも赤裸々に示されており、安易に進めることがまた新たな問題を生じさせてしまう可能性も示唆されます。リホーミングにおいては各動物種に最適な方法を慎重に選択することが必要でしょう。ある意味リホーミングではなくとも、残された1頭のように、実験施設や研究者自身が最初の飼養者としての責任を持ち、アニマルサンクチュアリのように実験施設や自宅での終生飼育を考えるといったことも実験動物の余生を考える選択肢の一つとなるようにも思います。

また 大変興味深いことに、今回リホーミングの対象となった認知研究について、著者らはビーグルを用いて実施していた実験法を家庭犬に用いることで、その後実験用ビーグルの必要性がなくなったと報告していました。動物実験とは通常実験動物を用いて行われるものではありますが、実験法を確立した後の実験には実験動物が必要なくなったということです。こうした動物実験の代替の可能性もあるのかもしれません。

もちろん研究対象は目的に拠るものですが、実際に動物用医薬品の開発でも医薬品の開発でも、ボランティアによる治験や臨床試験が行われます。動物実験とは実験動物を用いて実験をするという側面だけではなく、動物のことを研究して理解を深めてゆくことでもあります。動物の余生についても研究を重ね、多様な選択肢の中で考えを巡らせてみることは、改めて社会として適切な動物実験を実施するとは何かということを考える材料にもなるかもしれません。

(本コラムの引用文献は、クリエイティブコモンズライセンスの下に提供されています。)

コラム

マウスの系統間、亜系統間にみられる遺伝子型、表現型の違い〜 C57BL/6JとC57BL/6Nとの比較を中心に

 マウスは世界で最も多く用いられている実験動物です。実験用マウスには数多くの系統が樹立されており、なかでも20代以上兄妹交配を繰り返して作出された「近交系」と総称される系統は、個体間の遺伝的背景が均一であるため、実験成績にばらつきがないと予想されるので優れた実験動物であると考えられます。近交系マウスのうち最も多用される系統の一つがC57BL/6です。C57BL/6系統は樹立後の早い段階で異なる2施設で維持されはじめ、現在では2つの亜系統グループを形成しています。それぞれの亜系統グループの間では外見上の区別はつきませんが、詳しく比較すると遺伝子型や表現型に違いが見られるため、「似て非なる」「独立した」系統であるとも言えます。今回はいくつかの事例を引用しつつ、C57BL/6由来の亜系統に関してご紹介したいと思います。

 C57BL/6は、C. C. リトルがA. E. ラスロップから1921年に入手したマウスから樹立したC57BL系統に由来します[1]。C57BL/6系統は、1948年にアメリカのジャクソン研究所に導入され維持されてきましたが、1951年にはアメリカNIHに導入され、それぞれC57BL/6J, C57BL/6Nとして系統樹立されました。その後様々な施設に導入されて育成・維持された結果、現在ではC57BL/6JおよびC57BL/6Nからそれぞれ数多くの亜系統が派生しました(図1)。C57BL/6Jはマウス全ゲノム配列の決定に最初に用いられた系統であり、C57BL/6Nとともに一般的な動物実験のみならずトランスジェニック動物やノックアウト動物を作製する際にも頻繁に用いられています。

 種々の施設で独立して維持されているC57BL/6亜系統の間では、年月とともにゲノム配列の多型が蓄積されていると予想されます。岡山理科大学の目加田和之先生らは、イルミナ社のマウスSNPジェノタイピングアレイを用いたり、マウスゲノムの一塩基多型(SNP)データベースを比較することによってC57BL/6Jグループの亜系統とC57BL/6Nグループの亜系統の間に存在するSNPを検索し、さらに一部はゲノムシーケンスを行いSNPの存在を明らかにしました [2, 3]。その結果、C57BL/6J(ジャクソン研究所で維持されてきたC57BL/6J系統)とC57BL/6NJ(ジャクソン研究所で維持されてきたC57BL/6N系統)の間に存在するSNPのうち、277箇所を同定しました。その中には翻訳されるタンパク質のアミノ酸置換を伴う10箇所のSNPが含まれていました。さらに、これらのSNPはC57BL/6J亜系統の間においても、さらにはC57BL/6N亜系統間においてもそれぞれ保存の程度に差が見られ、亜系統の分岐の年代等によってSNPの蓄積度に違いがあることが明らかになったとのことです。

 C57BL/6JとC57BL/6Nの間にはタンパク質のアミノ酸置換を伴うSNPが存在しますが、それ以外にも一部の遺伝子において欠失の有無に差がみられます。例えば、ミトコンドリア内膜に存在し、抗酸化反応に関与する酵素タンパク質NADトランスヒドロゲナーゼタンパク質をコードするNnt遺伝子は、C57BL/6Jグループの亜系統ではexon 7-11が欠失しており、遺伝子機能が喪失しています [4]。 

 C57BL/6JとC57BL/6Nとの間にある遺伝子上の差違は、結果として表現型にも違いとして現れることは十分に予想されます。そして実際、数多くの表現型の差違がこれまでに報告されています。中には、表現型の違いが実験成績の解釈にまで影響を及ぼした例もあります。例えば、一般的に広く普及している解熱鎮静薬であるアセトアミノフェンは、過剰摂取により肝障害が起こることがあります。アメリカNIHのある研究グループが、MAPキナーゼカスケードに属するc-Jun N-terminal kinase 2 (JNK2)のノックアウトマウスを用いて、アセトアミノフェン誘導性肝障害に対するJNK2の役割について解析していました。彼らはジャクソン研究所からJNK2ノックアウトマウスを「C57BL/6Jを用いて作製された」マウスとして入手しました。そして、JNK2ノックアウトマウスは野生型マウス(C57BL/6J)よりも肝障害の程度が高かったことから、JNK2は肝障害に対して保護的な作用をもたらすと考えました [5]。ところが、他の研究グループからJNK2ノックアウトマウスは野生型マウスよりも肝障害の程度が低くなることが報告されました [6]。そこで、使用したJNK2ノックアウトマウスのNnt遺伝子を調べてみると、C57BL/6J系統に見られる欠失が存在しなかったそうです。さらに、C57BL/6J、C57BL/6N、および彼らが使用したJNK2ノックアウトマウスをそれぞれアセトアミノフェンを投与すると、下記の順序で肝障害の程度に有意差がみられたそうです。

           C57BL/6J < JNK2ノックアウトマウス < C57BL/6N

 すなわち、彼らが用いたJNK2ノックアウトマウスはC57BL/6JではなくC57BL/6Nを背景に持ち、コントロール系統としてC57BL/6Jを使用していたために、JNK2ノックアウトマウスはアセトアミノフェン誘導性肝障害がコントロールマウスより増悪していたように見えていたのです。従って、はじめは「JNK2はアセトアミノフェン誘導性肝障害に対して保護的な作用をもたらす」という結論を得たものの、実際のところは「JNK2は肝障害に対して増悪的な作用をもたらす」という結論が正しく、これは他の研究グループと一致したということです [7]。

 以上、C57BL/6JとC57BL/6Nの遺伝子型・表現型の違いについて簡単にご紹介致しました。C57BL/6JとC57BL/6Nはともに多くの亜系統があり、それぞれのグループの間に遺伝子型、表現型の違いが見られることがあります。C57BL/6JとC57BL/6Nは非常に多くの動物実験に使用されており、遺伝子改変動物の作製にも頻繁に利用されています。由来も同一で系統名もほとんど同じマウスですので、2つの系統を混同してしまうことが起こり得るかと思います。コントロール(野生型)マウスとして異なる亜系統のマウスを使用してしまい、そのことが結果として研究の結論にまで影響を及ぼす可能性があることなどは、頭の片隅に置いておいても良いのではないかと思います。また、過去の研究報告と自らの実験成績を比較・検討する際にも、用いた実験動物の系統については十分注意する必要があるでしょう。本webサイトのコラムに動物研究の報告のための指針である「ARRIVEガイドライン」に関する記事が掲載されております。ARRIVEガイドラインでは、実験動物の種・系統・亜系統・性別・年齢・体重などの情報を研究報告に記載することが推奨されております(項目8:実験動物)。用いた実験動物の詳細を明示しておくことは、研究データの有益性や利用性を向上させ、世界中の多くの研究者にとって多大な利益につながることが期待されることでしょう。

 (本コラムの引用文献、図は、クリエイティブコモンズライセンスの下に提供されています。)

参考文献

[1] Russell ES. Genetic origins and some research used of C57BL/6, DBA/2, and B6D2F1 mice. in: Gibson DC, Adelman RC, Finch C. editors. Development of the rodent as a model system of aging. Bethesda: DHEW Publ No. (NIH) 79–161; 1978. pp. 37–44.

[2] Mekada K and Yoshiki A. Substrains matter in phenotyping of C57BL/6 mice. Exp Anim. 2021. 70:145-160. doi: 10.1538/expanim.20-0158.

[3] Mekada K, Hirose M, Murakami A, Yoshiki A. Development of SNP markers for C57BL/6N-derived mouse inbred strains. Exp Anim. 2015. 64: 91–100. doi: 10.1538/expanim.14-0061.

[4] Huang TT, Naeemuddin M, Elchuri S, Yamaguchi M, Kozy HM, Carlson EJ, Epstein CJ. Genetic modifiers of the phenotype of mice deficient in mitochondrial superoxide dismutase. Hum. Mol. Genet. 2006. 15: 1187–1194. doi: 10.1093/hmg/ddl034.

[5] Bourdi M, Korrapati MC, Chakraborty M, Yee SB, Pohl LR. Protective role of c-Jun N-terminal kinase 2 in acetaminophen-induced liver injury. Biochem Biophys Res Commun. 2008. 374(1):6-10. doi: 10.1016/j.bbrc.2008.06.065.

[6] Nakagawa H, Maeda S, Hikiba Y, Ohmae T, Shibata W, Yanai A, Sakamoto K, Ogura K, Noguchi T, Karin M, Ichijo H, Omata M. Deletion of apoptosis signal-regulating kinase 1 attenuates acetaminophen-induced liver injury by inhibiting c-Jun N-terminal kinase activation. Gastroenterology. 2008. 135(4):1311-21. doi: 10.1053/j.gastro.2008.07.006.

[7] Bourdi M, Davies JS, Pohl LR. Mispairing C57BL/6 substrains of genetically engineered mice and wild-type controls can lead to confounding results as it did in studies of JNK2 in acetaminophen and concanavalin A liver injury. Chem Res Toxicol. 2011. 24(6):794-6. doi: 10.1021/tx200143x.

コラム

特集:マウスの最適な飼育室温度(1) NAFLD

実験動物の教科書には、実験用マウスの標準的な飼育室温は20~26℃と記載されています。一方、体温維持にエネルギーを使用しないマウスのサーモニュートラルゾーンは、30℃前後と言われています。室温がマウスの表現型に及ぼす影響を示した文献を紹介し、実験用マウスは何℃で飼育するのが最適なのかを、多面的に考えていきます。

文献紹介:非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)のモデルとしてのマウス -サーモニュートラル飼育により、性差のない悪化した病態を再現できる

Giles, D., Moreno-Fernandez, M., Stankiewicz, T. et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. 

Nat Med 23, 829–838 (2017). https://doi.org/10.1038/nm.4346

(概要)

 非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)は、肝硬変や肝細胞癌の前兆として知られている、世界的に最も一般的で重要なヒトの慢性肝疾患です。ヒトのNAFLDの病態を再現できるモデル動物を用いることで治療法の開発が可能になります。ところが、広く実験動物として利用されているマウスを用いた場合、高脂肪食給餌などの方法でNAFLDの症状が現れるものの、症状に性差が見られ、肝線維化の進行が制限されるなど、ヒトのNAFLDとは異なる病態を示すそうです。

 実験用マウスの標準的な飼育室温(TS)は20~26℃です(ILAR Guide)。一方、マウスが基礎代謝によって体温を維持できる室温、すなわちサーモニュートラルゾーン(TN)は30~32℃です。マウスをTN条件で飼育すると、寒冷ストレスが緩和され、カテコールアミンやコルチコステロイドの産生量が低下します。また、LPS投与による発熱反応が増強されます。すなわち「代謝」と「炎症」の両方に影響を及ぼします。そこで、著者らはTN飼育によって、より「ヒトに近い」NAFLDのマウスモデルを開発できるのではないかと考え、研究を行いました。

 実験の結果、TN飼育したマウスはTSと比較して、高脂肪食給餌による肝重量の増加、および肝脂肪症が悪化しており、肝臓のケモカイン発現、マクロファージの肝臓への浸潤、細菌の肝臓への移動が顕著に悪化したとのことです。また、ヒトNAFLD患者に類似した腸内細菌叢の変化、特にグラム陰性菌の拡大が見られました。さらにTlr4fl/flマウスとVav1-Creマウスを用いることにより、TN飼育と高脂肪食給餌によるNAFLDの病態進行に、造血系細胞のTLR4シグナルが関与していることが明らかになりました。TN飼育の肥満IL-17軸欠損マウス(Il17ra-/-およびIl17a-/-)は、TN飼育の野生型対照マウスと比較して、耐糖能異常、肝重量および肝細胞障害の悪化から免れました。一方、TN飼育と高脂肪食給餌により、C57BL/6では肝線維化は見られませんでしたが、AKRマウスでは肝線維化が誘導されたそうです。また、雄マウスのみならず雌マウスにもNAFLD様病態の徴候が見られました。以上のことから、TN飼育+高脂肪食給餌によるNAFLDの発症マウスは、免疫反応、代謝応答、腸内細菌叢の変化を伴う、より「ヒトに近い」新しい疾患モデルであることが明らかになりました。

【コメント】

 論文中のコメントにもありましたが、ヒトの場合、先進国では住居内の温度調節機能を利用して、一日の大半を中温域で過ごす傾向にあり、さらに着衣等も考慮に入れるとサーモニュートラルに近い環境で過ごしていると考えられます。遺伝子型だけでなく、飼育温度などの環境的要因を工夫することで表現型の変動をもたらし、ヒト疾患モデルを作出することができた点は、医学生物学の観点のみならず、実験動物学の観点からも興味深いと感じました。

(本コラムの引用文献は、クリエイティブコモンズライセンスの下に提供されています。)

コラム

文献紹介:犬、猫におけるミノキシジル外用薬の暴露状況とその毒性:211症例(2001-2019)

Topical Minoxidil Exposures and Toxicoses in Dogs and Cats: 211 Cases (2001-2019)

Kathy C. Tater, MPH, DVM, DACVD, Sharon Gwaltney-Brant, DVM, PhD, DABVT, DABT, Tina Wismer, MS, DVM, DABVT, DABT 

 Am Anim Hosp Assoc. 2021 Sep 1;57(5):225-231.  doi: 10.5326/JAAHA-MS-7154.

ミノキシジルは、CM等で宣伝されている育毛剤の主要成分です。この研究は、データベースに登録されている過去の症例報告に基づき、疾患の要因と発症の関連を調べた後ろ向き研究(retrospective study)であるため、エビデンスレベルは高くありません。本当の意味で犬・猫におけるミノキシジルの毒性を調べるためには、実験的に犬猫にミノキシジルを摂取させる(動物実験)、あるいは育毛剤を使用している飼い主と、使用していない飼い主に飼育されている犬猫の中毒症状の発症率を調べる、前向き研究(prospective study)が必要です。しかしながら、ミノキシジルの毒性については、種差(人間には安全な濃度でも、犬猫には危険)があり、犬猫は少量摂取するだけで臨床症状を呈する可能性があるので、育毛剤の保管や廃棄には十分注意が必要でしょう。また、ミノキシジルは重度の中毒を起こす危険性があるため、犬や猫の脱毛症の治療には使用しない方が良さそうです。

(要旨)

 この論文では、犬と猫におけるミノキシジルへの曝露と中毒の疫学を明らかにするために、米国の動物虐待防止協会の動物毒物管理センターにおけるデータベースに登録されているミノキシジル外用薬に暴露した犬と猫211症例を調べました。臨床的に中毒症状を呈した87例(猫62例、犬25例)については、病歴を詳細に検討しています。猫の場合、最も一般的な暴露状況としては、飼い主が自分の脱毛のためにミノキシジルを塗布している間の、意図しない摂取(例:ペットが飼い主の皮膚や枕カバーを舐めた、薬をこぼしたときにペットが飛び散った)が、最も一般的な暴露状況でした。犬では、探索行動(例:ゴミ箱の中を探す)による暴露状況が最も多く認められました。臨床症状を呈した症例では、ほとんどが中等度または重度の疾患を発症し犬56.0%、猫59.7%)、猫の場合、飼い主がミノキシジルを使用した後に臨床症状を呈した62例中8例(12.9%)が死亡しています。因果関係については、検討の余地はありますが、ペットの飼い主は、ミノキシジルの偶発的な暴露による犬や猫の中毒のリスクについて知っておく必要があります。

コラム

凄いぞ 実験動物! – 2021 年アルバート・ラスカー賞は光遺伝学 –

実験動物から得られた画期的成果をご紹介します。
〜国立大学法人動物実験施設協議会の許可を得て転載〜

 今年のアルバート・ラスカー基礎医学研究賞は光遺伝学の発展に貢献した 3 名の科学者 が受賞されました。本賞の受賞者はノーベル生理学・医学賞を授与されることが多く、た いへん権威ある賞です。ディーター・エスターヘルト博士は光駆動の水素イオンポンプ活 性を示すバクテリオロドプシンを発見、ペーター・ヘーゲマン博士は現在光遺伝学で汎用 されているイオンチャネル型の光活性化タンパクであるチャネルロドプシンを発見、カー ル・ダイセロス博士はこの分子を神経細胞に発現させ光応答させるシステムを作成、動物 の行動を光で制御することに成功しました。光遺伝学は実験動物の脳機能解析に応用され ており、多くの画期的な研究成果が得られています。今回は、その一部をご紹介します。

心を科学

 初めてのデートや失恋など強い感情はひとつの 記憶として心の中に長く残ります。この記憶は記 憶痕跡と呼ばれます。最近では記憶痕跡が脳のひ とつの場所だけでなく連携し広く存在していると 考えられているようです。事実、記憶には五感的 な要素が含まれ総合的なものなのです。2012 年にマサチューセッツ工科大学の利根川 進先生(1987 年ノーベル生理・医学賞受賞)たちはマウ スの記憶痕跡に関わる脳の特定の神経細胞にチャ ネルロドプシンを遺伝子操作で発現させ、マウス に恐怖体験をさせた後、光刺激のみでマウスの心に残っている恐怖体験の記憶痕跡を想起 させることに成功しました。心は形あるものの変化に基づいていることを光遺伝学と実験 動物で証明した画期的な研究です。

Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall Liu et al., (2012) Nature, 484: 381-385. doi: 10.1038/nature11028

冬眠スイッチ

 野生動物の一部は食料の乏しい冬をのりきるた めに冬眠することが良く知られています。SF 小 説や近未来映画では、長い宇宙旅行の間に歳を取 らないように、冬眠カプセルに入り、はるか遠い 銀河にある星へと向かう描写にしばしば出会いま す。これは夢物語なのでしょうか。2020 年に筑波大学の櫻井 武先生たちは通常は冬眠しないマウスの脳内に存在するピログルタミン化 RF アミドペプチド産生神経細胞(Q ニューロン)を化学的 もしくは物理的に興奮させると冬眠様状態へと誘 発できることを示しました。物理的方法では Q ニ ューロンにチャネルロドプシンを遺伝子操作で発現させ、ある領域の Q ニューロンを光で 刺激すると、マウスは冬眠同様に体温低下と低代謝を起こしました。驚いたことに光刺激 を止めると、体温は戻り、冬眠様状態による組織障害は起こらなかったようです。動物が 秘める冬眠様生理現象誘導の発見は、長期宇宙旅行に用いる冬眠カプセルが現実味のある 夢となり、それ以上に臨床医学では革新的治療への応用が大きく期待さられています。こ れらも光遺伝学と実験動物が開いた画期的な成果です。

A discrete neuronal circuit induces a hibernation-like state in rodents. Takahashi et al., (2020) Nature, 583: 109-114. doi: 10.1038/s41586-020-2163-6

コラム

文献紹介:英国で行われた実験動物のリホーミング実践に関する調査

A semi-structured questionnaire survey of laboratory animal rehoming practice across 41 UK animal research facilities

Tess Skidmore, Emma Roe

PLoS One. 2020 Jun 19;15(6):e0234922. doi: 10.1371/journal.pone.0234922.

概要
実験動物が福祉を損なうことなく実験を乗り切った場合、その将来について交渉しなければならない。リホーミングが考慮されるかもしれない。この論文では、英国の施設における動物のリホーミングの受け入れ状況と、リホーミングするかしないかの判断に関わる道徳的、倫理的、実用的、規制的な考慮事項を示す研究結果について報告している。本研究では、英国の研究施設でリホーミングされている動物の数や種類、リホーミングを行っている主な動機、リホーミングを行っていない施設にとっての障壁などを理解することで、広く知られている文献のギャップを解消することを目的としています。英国にある約160の研究施設のうち、41施設がアンケートに回答し、回答率は約25%でした。その結果、リホーミングは日常的に行われていることが示唆されましたが、その数は少なく、2015年から2017年の間にリホーミングされたとされる動物はわずか2322頭でした。少なくとも10施設のうち1施設はリホーミングを行っていることになります。ある種の動物(主に猫、犬、馬)が他の種(げっ歯類、農耕用動物、霊長類)よりも明らかにリホーミングされることを好む傾向があります。実際、実験室で飼育されている動物の94.15%がげっ歯類であるにもかかわらず、2015年から2017年の間にリホーミングされたことがわかっている動物の5分の1以下(19.14%)を占めています。リホーミングの主な動機は、スタッフの士気を高め、施設の倫理的プロファイルをポジティブにすることです。障壁となるのは、再帰の際の動物の福祉に対する懸念、動物に対する科学的な需要が高く、リホーミングの対象となる動物が少ないこと、そして、特定の動物(主に遺伝子組み換え動物)がリホーミングに適していないことです。この研究の結果は、リホーミングを選択している施設だけでなく、現在リホーミングを行っていない施設にも役立つものです。リホーミングを推進することで、実験動物の生活の質を向上させ、施設のスタッフが殺処分の道徳的ストレスを克服し、実験動物の運命に関する社会的関心に応えることができるという利点があります。英国の研究施設の視点から見たリホーミングについての理解が得られて初めて、適切な政策や支援が可能になります。

英国内務省の定義によると、リホーミングとは、”関連する保護対象動物を施設から、Animals (Scientific Procedures) Act に基づく施設ではないその他の場所に移動させること”とされています。そして、その「場所」としては、農場、水族館、動物園、または個人宅が選ばれています。

調査の結果、2015年から2017年の間に、英国の約160の施設のうち、少なくとも19施設、11.9%がリホーミングをしていました。リホーミングされた数は2322匹で、対象となる動物種に大きく依存していました。

実験室で飼育されている動物の94.15%がげっ歯類であるにもかかわらず、リホーミングされたとされる動物の5分の1以下(19.14%)であり、逆に、鳥類、猫、犬、馬、両生類、農業動物は、飼育されている動物のわずか5.84%を占めるにもかかわらず、リホーミングされた全種の80.86%を占めていました。

研究動物の殺処分は,

1)科学的要求
2)回避可能な苦痛を防ぐため(安楽死)
3)経済的・物流的理由

の3つの主な理由で行われますが、リホーミングの主な機会は、3)経済的・物流的な理由で人道的な殺処分が行われてしまう場合にあります

Directive 2010/63/EUでは、以下の場合に動物をリホーミングさせることができるとしています。

・「動物の健康状態がそれを可能にしている」場合
・「公衆衛生、動物の健康、または環境に危険がない」場合
・「動物の幸福を守るために適切な措置が取られている」場合

この指令では、リホーミングされると福祉が損なわれるような動物は、実験の終了時に殺処分されるべきであることが明示されています。

本研究では、動物が リホーミング に適しているかどうかを評価する際に、さまざまな要素が重要であると考えており、5段階の リホーミング のプロセスが示されています。

1. 動物の選択。健康状態、年齢、種類、気質、そして長期的な健康状態を左右するような処置を受けたかどうか。
2. 効果的な社会化とトレーニング。新しい環境への暴露、必要な医療処置(去勢手術など)の実施が含まれます。
3. 最適な住まいを見つけること。
4. 飼い主の能力を評価すること。これは非常に重要であると判断されています。基準としては、飼い主候補が、過去に動物を飼った経験があること、適切な住居があること、取り扱い能力があることを証明できなければならない。家を訪問/検査して、その適合性を確認することもあります。
5. 新しい飼い主の準備。いくつかの施設では、飼い主に適切な住居と初期のフードを提供しています。飼い主に動物の健康に対する責任と、ペットの飼い主としての法的責任を十分に認識させることの重要性があります。

リホーミングの実施にあたって、大半の施設は問題なかったと回答していましたが、リホーミングを困難にする要因として、プロセスに時間がかかることが挙げられています。

リホーミングの機会については、「スタッフの士気を高める」「積極的な倫理観を示せる」など、動物たちの将来の幸福が期待されていました。

リホーミングの障壁となることは、再帰化した場合の動物の健康に関する福祉面での懸念、需要や研究の必要性から退役する動物が少なくなる傾向にあるという現実的な問題、そしてメディアからの否定的な注目への懸念などの外的な課題が挙げられています。

リホーミング後、飼い主が興味を失って動物を処分してしまうことも考えられるため、動物が施設を離れた後の動物福祉の確保について心配されています。また、施設はリホーミングのプロセスが自分たちとその評判にどう影響するかをコントロールすることはできません。サンクチュアリや一般市民が動物の異常な行動や生理についてメディアで議論し、その結果、施設が否定的なイメージを持たれてしまうことが心配されています。

アンケートの結果、実験動物のリホーミングはよく知られており、検討されているが、その数は比較的少ないことが分かりました。数が少ないにもかかわらず、リホーミングを行っている施設では、動物の福祉、スタッフ、施設全体のためになると解釈しており、可能な限り検討すべきである。リホーミングは、スタッフのモラル・ストレスの克服をサポートするとともに、実験室での動物殺傷が日常的に行われていることに対する社会的な関心を喚起するものである。リホーミングを推進するためには、どの施設がどのようにリホーミングを行っているかについての理解を深め、現在この分野で活動していない施設にも情報を広めることが必要である。著者らはこのように結論付けています。

過去の報告から、リホーミングには、1)不必要な殺処分による精神的ストレスを回避する(負の状態の回避)、2)リホーミングした動物の生活の質を向上させる(正の状態の促進)、という双方向のプロセスが存在することが知られていますが、一方では動物福祉を損ねることにもなりかねないために慎重に実施する必要があるかもしれません。また、動物種は犬、猫に限られたことではないでしょうし、飼育数に反してリホーミングの機会の少ないげっ歯類について関心をもつことも必要かもしれません。

寄稿:実験動物の印象革命<前編>の中でもご紹介いただきましたが、私も過去に、知人のつてで実験動物であったマウスやスナネズミを譲り受け飼育した経験があります。もしかしたら過去には国内でも多くの施設がリホーミングを考えていたのかもしれません。

当時よりも動物福祉の考えが進む現在では、動物福祉を損ねることが憂慮されているのかもしれませんが、改めて多くの動物がリホーミングの機会を持つことが検討され、実験動物が社会の目に触れ、より適正な動物実験が考えられてゆくとよいなと思います。

(本コラムの引用文献は、クリエイティブコモンズライセンスの下に提供されています。)

特集

文献紹介:リホームされた実験用ビーグルは、日常的な場面でどのような行動をとるのか?観察テストと新しい飼い主へのアンケート調査の結果

How do rehomed laboratory beagles behave in everyday situations? Results from an observational test and a survey of new owners

Dorothea Döring, Ophelia Nick, Alexander Bauer, Helmut Küchenhoff, Michael H Erhard

PLoS One. 2017 Jul 25; 12(7): e0181303. doi: 10.1371/journal.pone.0181303. eCollection 2017.

概要
実験用の犬が一般家庭に戻されると、犬の生活環境は大きく変化します。慣れ親しんだ研究施設の限られた環境を離れ、新しい家庭では生物や無生物の様々な刺激に遭遇します。文献によると、リホームの経験はほとんど肯定的であるとされていますが、日常的な状況における犬の科学的な観察は行われていません。そこで我々は、74頭の実験用ビーグルを用いて、新しい家に迎え入れてから6週間後に観察テストを行った。このテストには標準化されたタスクと要素が含まれており、犬たちは新しい飼い主との具体的なやりとりや散歩中に観察されました。さらに、この74頭と71頭の飼い主は、里親になってから1週間後と12週間後に、標準化された電話インタビューに参加し、日常的な場面での犬の行動について質問に答えました。観察テストでは、犬は人間や犬に対してほとんど友好的に振る舞い、飼い主が操作している間も寛容で、散歩中は交通量が多くてもリラックスしていました。80%(n=71のうち)の犬は、リードを引っ張らずに行儀よく歩いていた。インタビューによると、大多数の犬が望ましい、友好的でリラックスした行動を示しており、アンケート結果は犬と飼い主の絆を反映していた。様々な要因(年齢、性別、出身地など)の影響を混合回帰モデルで分析したところ、過去2回の行動テストとインタビューの結果を確認することができました。具体的には、研究施設で飼育されていた犬は、研究施設が商業的な実験用犬のブリーダーから購入した犬よりも、有意に良いスコアを示した(p = 0.0113)。本研究の結果は、リホームされたビーグルたちが新しい生活環境にうまく適応できたことを示している。

ドイツでは、多くの企業や大学が長年にわたってリホーミングを促進しており、ドイツの動物福祉法は、脊椎動物の殺害を「正当な理由なしに」罰せられる犯罪と宣言しています。ドイツのほとんどの犬は、専門の動物福祉団体を通じてリホームされています。

本研究では、ドイツの製薬会社(Bayer AG, Leverkusen, Germany)で飼育されている145頭の実験用ビーグルが研究対象となりました。平均年齢±標準偏差は2.2±1.5歳、生後2か月から7.9歳のオス65頭、メス80頭でした。研究施設内の6m2の室内犬舎で、主に単独で飼育されており、少なくとも1日1回は屋外のランを利用していました。犬舎には、寝床、木製の噛みつき棒、犬用のおやつが用意されており、また、犬たちは採血、一般的な検査、経口投与、ワクチン接種などの医療行為に慣れていました。

インタビューの結果では、大多数の新しい飼い主は、愛犬が自分との接触を求め、撫でられるのが好きで、グルーミングも喜んで許可し、ほとんどの犬は、子供や他の犬を含む他の家族に対して友好的であると報告されました。犬たちは獣医師に対しても寛容で、通行人や見知らぬ子供に対する犬の行動は友好的で慎重でした。

見知らぬ子供、飼い猫、獣医師に対する行動だけが、時間の経過とともに若干悪化したとのことですが、時間の経過とともに望ましい行動の出現率が増加しており、犬は日常生活に適応し、飼い主との情緒的な結びつきが見られたと考えられています。

観察テストでは攻撃的な行動は見られませんでした。大多数の犬はリードをつけて行儀よく歩き、車やトラックが通りかかってもリラックスしていて、階段の上り下りも問題なくでき、犬たちはほとんどリラックスして望ましい行動をとっていました。これらの結果は、リホーミングされた実験犬の適応能力の高さを示すものであり、非常にポジティブな結果であったと著者らは考えています。

動物実験実施施設では実験動物福祉の考え方に基づき、それを実現するための管理をしています。少ない例ではありますが、寄稿:実験動物の印象革命<後編>でもご紹介いただき、こうした施設からリホーミングされた動物が、虐待を受けた動物のように人間に不信感をもっているということではなく、一般社会に上手く適応できるということであれば、動物実験実施者としての実験動物に対する気持ちは救われますし、嬉しくも感じるのではないでしょうか。

一方で、著者らは、ポジティブな結果については、研究施設の犬は刺激が少なかったことが理由でもあったのではないかとも考えています。全ての犬が良好な結果であったというものでもありませんでした。リホーミング実施の有無にかかわらず、動物実験実施者はより洗練した管理をしなければならないと、厳しく受け止める必要もあるのだと思います。

リホーミングを実施している施設は、実際のところ社会の期待よりも多くはないかもしれません。そうした施設がもっと多くなれば、実験動物の余生はより豊かになるでしょうし、安楽死を実施せざるを得ない場合の実施者の精神的負担も軽減されるでしょう。多くの実験動物が社会の目に触れることで、引き取られた実験動物を通じて一般社会が動物実験を知る機会も増えてゆくのではないでしょうか。そしてわが身を振り返るきっかけにもなるのではないでしょうか。

実験動物のリホーミングは、社会全体で適切な動物実験を考え遂行するために、鍵となる重要な手法かもしれません。

(本コラムの引用文献は、クリエイティブコモンズライセンスの下に提供されています。)

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