東京大学大学院農学生命科学研究科 獣医学専攻 実験動物学研究室
藤井渉

遺伝子改変モデル動物

　実験動物は、ヒトの疾患の発症メカニズムの解明やその予防・治療法の開発に極めて重要な役割を果たしています。ヒト疾患の再現を目的として、様々な疾患モデル動物の開発が続けられており、基礎研究だけでなく応用研究や創薬開発など幅広い分野で利用されています。
　疾患モデル動物の中でも、遺伝子改変モデル動物は、疾患の発症メカニズムや遺伝的背景を解明するうえで欠かすことのできないツールです。遺伝子改変モデル動物とは、遺伝子改変技術を用いてゲノム配列情報を意図的に改変した動物を指します。遺伝子改変モデル動物には、外来遺伝子を挿入することで新たな性質を持たせる「トランスジェニック動物」、特定の遺伝子を削除することでその機能を失わせる「ノックアウト動物」、または特定の遺伝子領域を目的に応じて改変する「ノックイン動物」など、様々なタイプがあります。特に遺伝子ノックアウトは、その動物内で通常は機能している遺伝子を人為的に破壊してしまうことで、その遺伝子が体の中でどのような生理的役割を果たしているか、また疾患とはどのように関与しているか、などを調べるうえで非常に重要な手法です。例えば、ヒトのある疾患で機能不全が示唆されるような遺伝子をモデル動物で破壊することで、その遺伝子と疾患との因果関係を示すことができ、さらには、そのような動物を用いて、新たな治療法の開発を進めることができます。
　かつて、遺伝子ノックアウト動物を作製するためには「ジーンターゲティング法」と呼ばれる方法が一般的に使用されていました。この方法では、増殖可能でかつ個体発生も可能な多能性幹細胞などを用いて遺伝子を改変するというプロセスが必要でしたが、この改変効率は非常に低いものでした。さらには、改変された幹細胞から動物個体を作出し、交配を繰り返すことで全身に遺伝子改変が反映された動物を得ますが、このプロセスにも非常に多くの時間、労力、コストを要し、研究者にとって大きな負担となっていました。また、作製に必要となる動物の個体数が多いことも課題でした。

ゲノム編集技術の登場

　このような背景の中で革新的なブレイクスルーがもたらされました。それが「ゲノム編集技術」の登場です。この技術は、細胞が持つ自然なDNA損傷修復機構を巧妙に利用したものです。我々の体内では、紫外線、化学物質、ストレスなどの環境要因によってDNA損傷が日常的に発生していますが、細胞にはこの損傷を迅速に修復する仕組みが備わっています。ゲノム編集技術は、この修復過程を利用してゲノムDNAを改変する技術です（図1）。具体的には、特定の場所でDNAを切断する酵素を用います。この酵素がゲノム中の標的部位を認識し、切断を行うと、細胞はその損傷を修復しようとします。しかし、修復過程でエラーが生じることがあり、その結果として目的の座位のDNA配列に欠失や挿入などの変異が起こり、もとの配列から変化してしまう、という仕組みを利用します。ゲノム編集を遺伝子がコードされている場所に利用すれば、変異によって遺伝子を壊すことができるため、特定の遺伝子の高効率なノックアウトが可能となりました。

図1． ゲノム編集

ゲノム編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc Finger Nuclease, ZFN）と呼ばれるDNA切断酵素の開発によって注目されるようになりました。この酵素は、DNAを認識するタンパク質ドメインのジンクフィンガーとDNAを切断する酵素を融合させたもので、ジンクフィンガー部分を特定の配列に結合するよう設計することで、ゲノムDNAの狙った部位を切断し、変異を導入できるようになりました。同様に、DNA結合タンパク質であるTALエフェクターとDNA切断酵素を組み合わせたTALEN（Transcription Activator-Like Effector Nuclease）も開発され、広く利用されてきました。一方、2013年には新たなゲノム編集ツールとしてCRISPR/Cas9システムが発表されました。このシステムでは、DNAを認識する部分が、ZFNやTALENのようなタンパク質ではなく、ガイドRNA（gRNA）と呼ばれる短いRNA分子によって構成されています。そのため、標的配列に合わせた設計が容易で、従来の方法に比べて手間をかけずに利用できるようになりました。ゲノム編集技術の研究は急速に進展しており、遺伝子改変動物の作製プロセスは劇的に効率化されました。従来のジーンターゲティング法で必要とされた幹細胞は使わずに、受精卵内で直接遺伝子改変を行えるようになり、個体化に必要なステップや動物の個体数を大幅に削減できるようになりました。3R（Replacement, Reduction, Refinement）の原則の理念にも適合する方法としても注目されています。マウスモデルでは、限られた機器と技術で遺伝子改変個体を作出できる方法も報告されており、これまで遺伝子改変研究に参入してこなかった研究者にも門戸が開かれつつあります。

表題：『動物福祉と法―欧米における動物実験規制―』
演者：本庄萌 先生（長崎大学）
進行：髙井了（中外製薬㈱） 日時：2024年11月22日（金）　時間16:00~17:00

酪農学園大学獣医学類　疾患モデル学　教授　北村　浩

　肝臓に中性脂肪が蓄積した状態を脂肪肝と呼びます。アルコールの多量な摂取により脂肪肝が生じることは古くから知られていますが、飲酒歴がない人やほとんど飲酒しない人も脂肪肝を生じることがあります。このようにアルコールを除くいろいろな原因で起こる脂肪肝の総称を非アルコール性脂肪性肝疾患（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）といいます。NAFLDは肥満やメタボリックシンドロームが関与する一種の生活習慣病であり、2型糖尿病を併発することが多い疾患です。先進国における肝障害の中では最も頻度が高く、世界で4人に一人はNAFLDに罹患しているという報告もあります[17]。近年、“エネルギー代謝異常が引き起こす肝疾患”という視点に立ち、NAFLDに代わる、MAFLD（metabolic-associated fatty liver disease）という呼び方も一般的になってきています[10]。NAFLDには、比較的軽症な非アルコール性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver, NAFL）と、炎症を伴い重症な非アルコール性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis, NASH）の２つの病態が知られています[15]。特にNASHは肝硬変や肝がんに進行する可能性があり、危険度の高い疾患といえます。私たち酪農学園大学獣医学類疾患モデル学ユニットでは、NAFLD克服のための新たな治療標的分子としてタンパク質の安定性を制御するユビキチン特異的プロテアーゼという酵素に注目しています。この酵素の遺伝子改変マウスがNAFLDやNASHの進行に果たす役割を調べています。このコラムではこれまで試みられたマウスの代表的なNAFLD/NASHモデルについて概説します。

1. NAFLD/NASHの典型的な病態

　中性脂肪が肝細胞に蓄積する脂肪肝はNAFLD患者で共通にみられる病態です。NAFLの状態から更に病状が深刻なNASHへ移行するかは様々な要因により決定されます。NAFLD患者の肝臓では酸化ストレスが蓄積し、脂質代謝異常が生じますが、これがトリガーになり炎症性細胞が肝臓に集積するという考え方は古くからあります[8, 18]。これに加えて、内臓脂肪組織からの悪玉アディポカインや、腸内細菌叢から門脈を介して伝わるエンドトキシンなどの成分もNAFLからNASHへの移行に影響を与えます[8, 18]。NAFLからNASHへの移行を組織学的に見ると、初期の肝細胞に脂肪滴が観察される脂肪肝、その後、血管周囲から肝実質へ広がる白血球の浸潤（炎症）、肝細胞の空胞変性、さらにはコラーゲン線維の蓄積による線維化（硬化）病変へと進行します。げっ歯類でNAFLDを誘導する際、特に問題となるのは、肝細胞の空胞化や血球の浸潤などNASHに特徴的な肝炎病変をなかなか惹起できない点が挙げられます[10, 15]。そこでNASHに進行させるための様々な工夫がこれまでなされてきました。大きく分けて特殊飼料を給餌させるモデル、特定の遺伝子を改変したモデル、それらの組み合わせモデルが知られています。

２．食餌性NAFLD/NASHモデル

　NAFLDは生活習慣病であることから、げっ歯類にも栄養学的に誘導することが試みられました。例えば71%脂質、11%炭水化物、18%のタンパク質からなる高脂肪餌をラットに3週間給餌するとインスリンの効きが悪くなるインスリン抵抗性の誘導と共にNASHの病態を示します[14]。マウスの場合はラットよりNASHを起こしにくいとされ、通常の高脂肪餌の場合1年近くの時間を要することもあります[7]。また、マウスでは食餌性NAFLD誘導における病理変化も比較的弱く、炎症像や線維化像は限定的です。一方で、マウスの場合、系統差が顕著で、例えばC57BL/6系統でもC57BL/6JマウスはC57BL/6Nマウスとくらべて、高脂肪餌給餌後の肝臓へ中性脂肪の蓄積は顕著ですが、肝障害は小さいという報告があります[9]。

　洋食に豊富に含まれるコレステロールはヒトでは脂肪性肝炎の主要な原因となります。マウスの場合、1%のコレステロールを給餌するとインスリン抵抗性になりますが、肝重量の増加や血中の脂質量の増加は限定的であり、NASHを含む肝障害には至らないと言われています[14]。一方でコレステロール（例えば1.25%）に一次胆汁酸であるコール酸（例えば0.5%）を加えた餌を与えることもあります。この場合、24週後の肝臓では脂肪の蓄積のみならず肝炎や線維化が認められます[14]。また高コレステロール・コール酸餌に40-75%の中性脂肪を加えることで病状を悪化させることが可能であり、早ければ12週目にはNASHの病態をマウスで観察できます[14]。高コレステロール餌給餌で注意しなければいけないのはコレステロールの量です。１％を超えるコレステロールを与えると、たとえ高脂肪餌を与えても、むしろ内臓脂肪量の減少や体重の減少をもたらすので、ヒトのNASHモデルとは言い難い状態になります[5, 18]。

茨城大学農学部　　　鈴木 穂高

【はじめに】

　私達が普段口にする食品には様々な規格や基準が定められており、その安全性が守られています。『食品衛生検査指針』という本には、食品の安全を守るために必要となる、食品保健行政に関わる公定試験法とそれに準じる標準試験法がまとめられています。いわば食品衛生試験法のバイブルともいえる本です。公定試験法とは、食品衛生法や厚生労働省の通知などで定められた検査法のことです。成分規格のある食品は公定試験法に従って試験を行わなければなりません。公定法とも言われます。

　『食品衛生検査指針Ⅰ（検査法別）』は昭和48（1973）年、『食品衛生検査指針Ⅱ（食品別）』は昭和53（1978）年に厚生省監修で発刊されており、その後は約10数年ごとに改訂されています。平成元～3（1989～1991）年の第一次改訂からは、微生物編、理化学編等に分けて発刊されており、改訂を重ねるごとに総ページ数は増しています。

　今、私の手元には『食品衛生検査指針 微生物編 1990』¹⁾（1990年発刊）、『食品衛生検査指針 微生物編 2004』²⁾（2004年発刊）、そして最新版の『食品衛生検査指針 微生物編 改訂第2版 2018』³⁾（2018年発刊）という3冊の『食品衛生検査指針 微生物編』があります*^注。食品の微生物検査法は、培養によるもの（細菌や真菌など）、顕微鏡観察によるもの（寄生虫など）、遺伝子検査によるもの（ウイルスなど）が大部分を占めていますが、一部に実験動物を用いた検査法も存在します。本稿では、これら3冊の『食品衛生検査指針 微生物編』に掲載されている動物実験に着目し、その実験内容と改訂に伴う推移についてご紹介したいと思います。

山梨大学総合分析実験センター　准教授　兼平雅彦

I. はじめに

“ミネラル調節”と聞いて、皆さんはどんなイメージをもつでしょうか？「熱中症予防には水ではなくスポーツドリンクが有効」「加齢、運動不足等で骨が脆くなる」等々。魚類ではどうでしょうか？海水には淡水に比べ、ナトリウムやマグネシウムなどの大量のミネラルが存在するため、海水魚と淡水魚の生育環境は著しく異なります。しかし、料理に用いる調味料の量はだいたい同じです（全く違うというプロの意見もあるかもしれませんが・・・）。高校生物の知識を思い起こすと、淡水魚は、鰓で水中の塩類を積極的に吸収し、低張な尿を大量に排泄することで、体液中の塩類濃度を外部環境より高く保っています。一方、海水魚は、海水を大量に飲みこみ、水分を腸から吸収しつつ、過剰な塩類を鰓から積極的に排出し、かつ等張の尿を少量排泄することで、体液の塩類濃度を外部環境より低く保っています。ここではミネラルの一元素カルシウムを中心に話を進めますが、魚類、特に海水魚は、飲水から常時カルシウムが体内に流入しますので、常に血中カルシウム濃度が高値になる恐れがあります。一方、主に陸上で生活する爬虫類、鳥類、哺乳類は、摂餌によりカルシウムを腸管から吸収し、リン酸カルシウムの形で骨に貯蔵して必要に応じて利用します。すなわち、血中カルシウム濃度に関しては、魚類、特に海水魚は「下げる」メカニズム、爬虫類、鳥類、哺乳類は「上げる」メカニズムが重要といえます（以下、本稿では魚類と哺乳類に限って話を進めます）。魚類の血中カルシウム濃度を下げるホルモンとしてスタニオカルシン-1が知られていますが、哺乳類では同じスタニオカルシン-1が全く別の働きをしています（図１）。本コラムでは、姿形を変えずに、役割を変えることで生き残った不思議な分子、スタニオカルシン-1について紹介します。

　核酸ワクチンなどの新規剤型ワクチンが国内で承認され、薬事承認の過程を含む「いわゆる教科書」が書き換えられつつある。その影響か、マスコミ等で臨床試験や承認申請のスケジュールについて採り上げられることはあるいっぽうで、非臨床試験(動物実験)の経過を耳にすることはほとんどない。非臨床試験への社会的な関心度が低いとみなされているのかどうかはともかく、「非臨床試験の内容についても情報発信されている」ことを、ワクチンを例に紹介したい。

　独立行政法人医薬品医療機器総合機構(PMDA)は、医療用医薬品情報を公表している ¹⁾。この情報検索サイトで「ワクチン」の「審査報告書等」について文書検索すると、84件のワクチンが表示された (2022年8月末)。内訳は、インフルエンザ関連が28件、新型コロナ関連、麻しん関連、風しん関連が各7件、肺炎球菌が5件、百日せき関連、ジフテリア関連、破傷風関連、ポリオ関連、パピローマが各4件、ヘモフィルスb型と日本脳炎が各3件、水痘、おたふくかぜ、狂犬病、A型肝炎、B型肝炎、ロタウイルスが各2件、黄熱、結核、痘そう、帯状疱疹、髄膜炎菌が各1件とある (混合ワクチンは複数件にカウント)。同様に、一般社団法人日本医薬情報センター(JAPIC)では、1998年以降の医療用医薬品「日本の新薬」について検索可能である²⁾。

　PMDAのサイトでは「審査報告書」に加え「申請資料概要」も公表されていることが多く (一部内容に未公表あり)、製造販売業者が提出した資料の概要、すなわち、開発の経緯や、承認申請までに実施した非臨床試験及び臨床試験の内容を垣間見ることができる。非臨床試験の内容については日付や実施機関などを除いて「審査報告書」内で開示されており、試験の目的のほか、げっ歯類や霊長類の使用についても具体的に記載されている。あるワクチンの非臨床試験結果には、「若齢及び高齢のマウス、ラット、ハムスター及びNHP(non-human primate、この場合はアカゲザル)において、高レベルの結合抗体及び中和抗体を誘導し、(以下略)」とある。また、「効力を裏付ける試験 (免疫原性試験、攻撃試験)」、「安全性薬理試験 (反復投与毒性試験、生殖発生毒性試験)」や「薬物動態試験 (生体内分布評価試験)」が行われたことのほか、このワクチンが臨床で6か月以上継続使用されないことから「がん原性試験」を実施していないことが記されている。

　現在では、化学物質、活性酸素、ウイルス感染、生活習慣や加齢など、さまざまな原因により複数の遺伝子に異常が生じ、がんが生ずることがわかってきている。本コラムでは、実験動物学の黎明期である1900年代初頭の化学発がん説やウイルス発がん説が優勢な頃、マウスを用い、がん遺伝説を提唱したモード・スライ（Maud Slye）を紹介します。

独楽鼠（こまねずみ）

　リンネが名付けたマウスの学名「Mus musculus（ラテン語）」のmusは古代サンスクリット語の「泥棒」を意味するmushaに由来している。ディズニーが自室に迷い込んだマウスを餌付けし、このマウスを参考にキャラクターを考案したというのは架空の話のようだが、招かれざる客が、歓迎すべき客となり、飼い慣らし繁殖したものが現在の愛玩用マウス（ファンシーマウス）になったとの説が有力である。他の愛玩動物と同様、古代より愛好家たちは、興味深い毛色や行動パターンを持つ珍しいタイプを選んで交配・維持してきたようだ。1920年代には、英米でマウス愛好家組織が結成されたほどポピュラーな存在になった。このムーブメントは1927年のミッキーマウスの誕生にも影響を与えたかもしれない。

　1890年代の米国では、ワルツを踊るようにくるくる回る、ジャパニーズワルチングマウス（Japanese waltzing mouse ：JWM）がペットとして人気を博した。心理学者のロバート・ヤーキーズは、このマウスの由来や習性を調べ本にまとめている [1]。このワルツを踊るマウスは、紀元前の中国の漢の時代の文献に登場している。日本では独楽鼠または舞鼠と言われていた。JWMは、中国から日本を経て欧州に到着し、その後、米国に上陸したと思われる。ヤーキーズが所有したJWMは、白地に黒の斑点や縞模様が入っていたことから、JF1マウス（パンダマウス）と同様、エンドセリン受容体B型遺伝子（Ednrb）の変異をもっていたのであろう [2]。JWMは、旋回運動を示すほか難聴でもあり、これらの症状は、遺伝性の内耳の構造異常に起因する場合が多い。平衡感覚がおかしいので、体勢を維持するために旋回するのである。この表現型（遺伝変異）を持つマウスは1947年にジョージ・スネルによってジャクソン研究所へ導入後、近交系C57BL/10に交配することで変異遺伝子が維持され、現在でも同所に受精卵が凍結保存されている[2]。2001年に、聴覚と平衡感覚器官の異常の原因としてカドヘリン23遺伝子の変異が同定された [3, 4]。また、カドヘリン23は、人の先天的難聴を伴う遺伝病であるUsher症候群の原因遺伝子と同一であることが判明した [5]。

The First Rehoming of Laboratory Beagles in Finland: The Complete Process from Socialisation Training to Follow-up

Laura Hänninen, Marianna Norring

Altern Lab Anim. 2020 May; 48(3): 116-126. doi: 10.1177/0261192920942135

フィンランドでは、科学的または教育的目的のための動物の使用を対象とする国内法（Act 497/2013）があり、科学的目的のために使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63/EUに基づいています。
EU指令は実験動物の運命に関わり、すべての欧州機関に実験犬が実験用途に不要になった後にリホーミングする機会を与えています。
Article 19では、実験に使用された動物は、動物の健康状態がそれを許し、公衆衛生、動物の健康、環境に対する危険がない場合、一定の条件を満たせば、リホーミングすることができるとしています。また、EU指令の前文26には、「手続きの最後に、動物の将来に関して、動物福祉と環境への潜在的なリスクに基づいて、最も適切な決定がなされるべきである。福祉が損なわれるような動物は、殺処分されるべきである」との記述もあります。
したがって著者らは、暗黙の了解として福祉が損なわれない動物は殺処分されるべきではないと考えています。
本研究は、フィンランドで行われた実験用ビーグルの最初のリホーミングと社会化プログラムについて述べたものです。

　今年のアルバート・ラスカー基礎医学研究賞は光遺伝学の発展に貢献した 3 名の科学者 が受賞されました。本賞の受賞者はノーベル生理学・医学賞を授与されることが多く、た いへん権威ある賞です。ディーター・エスターヘルト博士は光駆動の水素イオンポンプ活 性を示すバクテリオロドプシンを発見、ペーター・ヘーゲマン博士は現在光遺伝学で汎用 されているイオンチャネル型の光活性化タンパクであるチャネルロドプシンを発見、カー ル・ダイセロス博士はこの分子を神経細胞に発現させ光応答させるシステムを作成、動物 の行動を光で制御することに成功しました。光遺伝学は実験動物の脳機能解析に応用され ており、多くの画期的な研究成果が得られています。今回は、その一部をご紹介します。

心を科学

　初めてのデートや失恋など強い感情はひとつの 記憶として心の中に長く残ります。この記憶は記 憶痕跡と呼ばれます。最近では記憶痕跡が脳のひ とつの場所だけでなく連携し広く存在していると 考えられているようです。事実、記憶には五感的 な要素が含まれ総合的なものなのです。2012 年にマサチューセッツ工科大学の利根川 進先生(1987 年ノーベル生理・医学賞受賞)たちはマウ スの記憶痕跡に関わる脳の特定の神経細胞にチャ ネルロドプシンを遺伝子操作で発現させ、マウス に恐怖体験をさせた後、光刺激のみでマウスの心に残っている恐怖体験の記憶痕跡を想起 させることに成功しました。心は形あるものの変化に基づいていることを光遺伝学と実験 動物で証明した画期的な研究です。

Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall Liu et al., (2012) Nature, 484: 381-385. doi: 10.1038/nature11028